【培養(yǎng)保存】

培養(yǎng)體系：DMEM+10%FBS+1%PS

培養(yǎng)條件：氣相:空氣,95%;CO2,5%;溫度:37℃

凍存條件：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%DMSO+20%FBS，液氮保存

【傳代步驟】

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次；

2. 加 1ml 消化液于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 2-4 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加胰酶 3 倍體積的培養(yǎng)基終止消化；

3. 用巴氏管輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 5 分鐘，棄去上清液，加入培養(yǎng)液后吹勻；

4. 收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按 1：2 的比例分到新的含 6ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按 1:2 到 1:4 的比例進(jìn)行。

【凍存步驟】

1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入 3ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；

2. 5min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和 DMSO，輕輕混勻， DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于 1x10(6)/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)；

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。