誘導(dǎo)性多能干細胞Induced Pluripotent Stem Cells (iPS)
iPS細胞的介紹
iPSC源自皮膚 細胞 或血細胞，它們已被重新編程為胚胎樣的多能狀態(tài)， 具有與胚胎干細胞相似的分化潛能， 從而能夠開發(fā)出無限量的治療用途所需的 各種 類型的人類細胞。誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)（iPS ）的出現(xiàn)不僅允許我們對干細胞的復(fù)雜特性有了更好的學(xué)術(shù)理解，還為患者提供了創(chuàng)建個性化的、特定的干細胞治療方法的可能。例如， iPSC 可以促使成為 β 胰島細胞來治療糖尿病，血細胞可以為白血病患者提供不含癌細胞的新血液，也可以促使神經(jīng)元來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
由于體細胞可藉由將核送入卵中或是和胚胎干細胞核融合而被重建，科學(xué)家們猜測必定有某些基因?qū)⒓毎S持在多能性的狀態(tài)。 2006年 8 月，日本的山中伸彌（ Shinya Yamanaka) 團隊 研究了24個相關(guān)基因并 將 其中 四個基因 (Oct3/4,Sox2,c-myc和 Klf4 ) 送入已分化完全的小鼠纖維母細胞，把纖維母細胞重新編排變成全能性的類胚胎干細胞。他們將重新編排細胞稱之為”誘導(dǎo)式多能性干細胞 ” ，即 iPS 細胞。
2007年 11 月 20 日，美國的 Thomson 實驗室第一次成功地由人類的體細胞誘導(dǎo)為 IPS 細胞。他們從 14 個保持人類 ES 細胞多能性狀態(tài)的基因篩選出四個基因 OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28 ，將之用慢病毒載體轉(zhuǎn)入人類體細胞中，得到了在增殖能力，形態(tài)學(xué)，核型，端粒酶活性，細胞表面標志， ES 特征基因表達，畸胎瘤擬胚體形成能力上與人類 ES 相似的 IPS 細胞。
2007年 11 月 20 日，日本 Yamanaka 實驗室用人類的成纖維細胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入 Oct3/4,Sox2, Klf4, c-Myc 四個基因，也成功得到了人類的 IPS 細胞。同時，他們還成功的將這些 iPS 細胞誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞，心肌細胞。
iPS細胞的鑒定
iPS 細胞是一種人為誘導(dǎo)的類胚胎干細胞，其特性在多個方面，如細胞形態(tài)、基因蛋白的表達、分化能力等都與胚胎干細胞相似。因此可以通過胚胎干細胞的幾個特點來鑒定 i PS 細胞是否誘導(dǎo)成功。
胚胎干細胞具有正常穩(wěn)定的二倍體核型和帶型；
胚胎干細胞具有較高的端粒酶活性和堿性磷酸酶的表達。 人胚胎干細胞系端粒酶活性都很高，說明其可在體外未分化狀態(tài)進行長期培養(yǎng)。
人胚胎干細胞特異表面抗原的表達。細胞膜表面有特殊的標記： SSEA-3, SSEA-4 ， TRA-1-60, TRA-1-81 。鼠和人胚胎干細胞表達的表面抗原有種屬差異。
具有轉(zhuǎn)錄因子Oct -4 的表達。Oct 4 只限定在多潛能細胞種表達。人和小鼠的胚胎干細胞種都表達 Oct4 ，當胚胎干細胞分化時，其表達能力大大降低，因此O ct4 可能是哺乳動物不同發(fā)育階段多潛能細胞所特有的少數(shù)特異的調(diào)控分子之一;
不被 Hoechst 33342和羅丹明 123 染色；
能分化成三個胚層的細胞，將胚胎干細胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤；
可以被誘導(dǎo)分化成各種成體干細胞。
胚胎階段特異性抗原 | SSEA-1 | SSEA-3 | SSEA-4 |
Thmoson 分離的hES | 陰性 | 弱陽性 | 強陽性 |
Gearhart分離的 hES | 陽性 | 弱陽性 | 陽性 |
小鼠ES | 陽性 | 陰性 | 陰性 |
用于產(chǎn)生ips細胞的基因
iPS細胞的生成至關(guān)重要地取決于用于誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子。 已經(jīng)確定 Oct-3 / 4和 Sox 基因家族的某些產(chǎn)品（ Sox1 ， Sox2 ， Sox3 和 Sox15 ）是參與誘導(dǎo)過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由于缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因此無法進行誘導(dǎo)。但是，其他基因，包括 Klf 家族的某些成員（ Klf1 ， Klf2 ， Klf4 和 Klf5 ）， Myc 家族（ c-myc ， L-myc 和 N-myc ）， Nanog 和 LIN28 被鑒定為提高感應(yīng)效率。
Oct-3 / 4（ Pou5f1 ） ： Oct-3 / 4是八聚體（ “ Oct” ）轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在維持多能性中起關(guān)鍵作用。 Oct-3 / 4 + 細胞（如卵裂球和胚胎干細胞）中不存在Oct-3 / 4，導(dǎo)致自發(fā)滋養(yǎng)層細胞分化，而 Oct-3 / 4 的存在會引起胚胎的多能性和分化潛能干細胞。 “ Oct” 家族的其他基因，包括 Oct-3 / 4 的近親， Oct1 和 Oct6 不能誘導(dǎo)，因此證明了 Oct-3 / 4 對誘導(dǎo)過程的排他性。然而，由 HansSchöler 領(lǐng)導(dǎo)的一個團隊（他于 1989 年發(fā)現(xiàn)了 Oct4 基因） 表明，在重新編程過程中 Oct4的過度表達會導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)變化，從而降低 iPSC 的質(zhì)量。與 OSKM （ Oct4 ， Sox2 ， Klf4 和 c-Myc ）相比，新的 SKM （ Sox2 ， Klf4 和 c-Myc ）重編程生成的 iPSC 具有與胚胎干細胞同等的發(fā)育潛力，這取決于它們通過四倍體產(chǎn)生全 iPSC 小鼠的能力胚胎互補。
Sox家族 ： 和Oct 3/4 相似， 轉(zhuǎn)錄因子的Sox家族與維持多能性 相關(guān)；但 Oct-3 / 4 不同 的是 它 也 與 專能 能干 細胞 和單能干細胞有關(guān) ， 而Oct-3 / 4僅在多能干細胞中表達。 Sox2 是 Yamanaka 等人， Jaenisch 等人和 Thomson 等人用于誘導(dǎo)的起始基因，但已發(fā)現(xiàn) Sox 家族中的其他轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)過程中也起作用。 Sox1 產(chǎn)生的 iPS 細胞的效率與 Sox2 相似，并且，盡管效率有所降低 ， Sox3 ， Sox15 和 Sox18也會產(chǎn)生 iPS 細胞。
Klf家族： Yamanaka等人最初鑒定 ， 并由Jaenisch等證實了轉(zhuǎn)錄因子 Klf 家族的 Klf4 使產(chǎn)生小鼠i PS 細胞的重要因素。然后，Yam anaka 等人又證明了該基因在誘導(dǎo)i PS 細胞也起到關(guān)鍵作用。 然而，湯姆森等 卻報告 說Klf4對于生成人 iPS 細胞是不必要的，并且實際上不能生成人 iPS 細胞。 另一方面， Klf2 和 Klf4 也被發(fā)現(xiàn) 是能夠產(chǎn)生iPS細胞的因子，相關(guān)基因 Klf1 和 Klf5 也起作用，盡管效率降低。
Myc家族 ：轉(zhuǎn)錄因子的Myc家族是與癌癥有關(guān)的原癌基因。山中 團隊 和Jaenisch 團隊研究發(fā)現(xiàn)c -Myc 是與小鼠i PS 細胞生成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；同時，山中團隊發(fā)現(xiàn)其也是與人i PS 誘導(dǎo)有關(guān)的因素。但是， “ myc”家族基因在誘導(dǎo) iPS 細胞中的應(yīng)用令人不安，因為 iPS 細胞最終可能作為臨床療法使用， 而 移植有c-myc誘導(dǎo)的 iPS 細胞的小鼠中有 25 ％會形成致命的畸胎瘤。已確定 N-myc 和 L -myc 具有與c -Myc 相似的誘導(dǎo)效率作為替代品。
Nanog： 在胚胎干細胞中，Nanog與 Oct-3/4 和 Sox2 一起是促進多能性所必需的。因此，當 Yamanaka 其研究中 提出 其并非必須的轉(zhuǎn)錄因子時令人震驚。
LIN28： LIN28是一種 mRNA 結(jié)合蛋白，在胚胎干細胞和胚胎癌細胞中表達，與分化和增殖有關(guān)。 Thomson 團隊 證明 LIN28與 OCT4 ， SOX2 和 NANOG 組合是 iPSC 產(chǎn)生的一個因素。
Glis1： Glis1 是轉(zhuǎn)錄因子，可與Oct-3 / 4， Sox2 和 Klf4 一起使用以誘導(dǎo)多能性。當代替 C-myc 使用時，它具有許多優(yōu)點。
iPS 技術(shù)路線
首先將幾種轉(zhuǎn)錄因子（一般為Sox2, Oct3/4, Klf4及 c-Myc 或其替代品）基因通過 pcr 技術(shù)擴增并克隆到慢病毒表達載體上，通過病毒包裝獲得帶有轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒，并將 4 種慢病毒共感染宿主細胞（人成纖維細胞）。感染后的宿主細胞需要被種植到滋養(yǎng)層細胞上并用胚胎干細胞專用培養(yǎng)體系培養(yǎng)。 2 周后形成顆粒狀菌群，再兩周后即會產(chǎn)生與胚胎干細胞形態(tài)相似的顆粒狀菌群。從顆粒狀群落中挑出類胚胎干細胞的群落并擴大培養(yǎng)，即獲得未經(jīng)鑒定的類胚胎干細胞，即 iPS 細胞。獲得細胞后需要對細胞進行干細胞檢測鑒定，包括胚胎干細胞 marker 的表現(xiàn)、端粒酶活性測試等。
Fig. 1 iPS技術(shù)路線
Fig.2 成纖維細胞誘導(dǎo)i PS 細胞的生長過程
iPSC 細胞分化
人類 iPSC 具有獨特的能力，可以分化為人體的任何細胞類型，包括：
外胚層： 神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞，視網(wǎng)膜上皮細胞（RPE），表皮，毛發(fā)和角質(zhì)形成細胞。
內(nèi)胚層： 肝細胞，胰島β-胰島細胞，腸上皮細胞，肺泡細胞。
中胚層： 造血，內(nèi)皮細胞，心肌細胞，平滑肌細胞，骨骼肌細胞，腎細胞，脂肪細胞，軟骨細胞和骨細胞。
影響細胞分化的因素
1.受特定的基因決定。
細胞分化的實質(zhì)是細胞按照一定程序發(fā)生的差別基因表達。不同類型的細胞在發(fā)育過程中表達一套特異的基因，其產(chǎn)物不僅決定細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且執(zhí)行各自的生理功能。差異基因分為管家基因和奢侈基因。管家基因是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的，比如核糖體蛋白等，細胞沒了這些基因就不行。奢侈基因又稱組織特異性基因，是指不同的細胞類型進行特異性表達的基因，其產(chǎn)物賦予各種類型細胞特異的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與特異的功能，比如紅細胞的血紅蛋白基因，皮膚的角蛋白基因。
2. 兩大調(diào)控因子 。
分化抑制因子和生長因子。比如，胚胎干細胞在含有白血病抑制因子（LIF）和維生素 A 酸（ RA ）的培養(yǎng)基上，分化成全壁內(nèi)胚層。若與胚胎細胞共培養(yǎng)或?qū)⑴咛ジ杉毎⑷肽遗咔恢校咛ジ杉毎蜁⑴c多種組織的發(fā)育。
影響定向分化的因子包括轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子以及化學(xué)誘導(dǎo)劑的體外誘導(dǎo)。目前對于細胞因子領(lǐng)域研究較多。比如苯丙酸諾龍（ Activin-A ）和轉(zhuǎn)化生長因子（ TGF ）能誘導(dǎo)中胚層的形成；視黃酸（ RA ）、表皮生長因子（ EGF ）、骨形成蛋白 4 （ BMP4 ）和堿性成纖維細胞生長因子（ FGF2 ）促使胚胎干細胞細胞向外胚層和中胚層分化；神經(jīng)生長因子（ NGF ）和干細胞生長因子（ HGF ）促使胚胎干細胞向三個胚層的細胞分化， BMP4 還能誘導(dǎo)胚胎干細胞發(fā)育為滋養(yǎng)層細胞。干細胞的 3 中體外誘導(dǎo)分化途徑，包括外源誘導(dǎo)因子，轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)，和細胞共 培養(yǎng)誘導(dǎo)。
控制 ES / iPS 自我更新和分化的機制受多種生長因子，受體，細胞內(nèi)信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的影響。 細胞命運的確定通常需要嚴格調(diào)控生長因子呈遞和轉(zhuǎn)錄因子表達的時間順序。下圖表示了會影響 ES / iPS多能性，增殖和 譜系定向的各個因素。
Fig.3 iPS 細胞的分化調(diào)控