腺病毒(adenovirus,Ad)是一種球形、無包膜、直徑約70~80 nm顆粒病毒,腺病毒基因組為大小為36kb的雙鏈線性DNA,兩端各有長約100 bp的反向重復(fù)序列,編碼30多種”調(diào)控蛋白“。腺病毒為20面體立體對稱結(jié)構(gòu),由252個殼粒組成,衣殼含有240個六連體(Hexon),12個五連體(penton)和位于表面的纖維狀刺突,纖維狀刺突由12根纖毛(fiber),以5連體單位為基底由衣殼表面伸出,纖毛頂端形成頭結(jié)區(qū)(Knob),在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,而后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),游離于染色體外,但不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。腺病毒已知有52種,分別命名為adl-ad52,研究得最詳細(xì)是ad2和ad5,廣泛應(yīng)用于疫苗和體外體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域。
一、腺病毒優(yōu)勢
1).可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細(xì)胞后而少游離于細(xì)胞基因組外,并持續(xù)表達(dá);
2).病毒滴度高,病毒顆粒相對穩(wěn)定,并易于純化和濃縮,且能有效進(jìn)行增值。
3).腺病毒載體感染的宿主范圍非常廣,容易制備,操作簡單。
4).該病毒可感染分裂和非分裂的細(xì)胞,并能得到大量基因產(chǎn)物,不存在激活致癌基因或插入突變等危險。
5).載體容量大可插入7.5kb的外源基因。
二、腺病毒包裝系統(tǒng)
腺病毒包裝系統(tǒng)按照重組方式主要分為兩種,一種在細(xì)菌(BJ5183)中重組,為AdEasyTM腺病毒重組系統(tǒng),另外一種在QBI-293A細(xì)胞中重組,為AdMax腺病毒重組系統(tǒng)。
1.Adeasy腺病毒包裝系統(tǒng)
Adeasy系統(tǒng),利用E.coil BJ5183 的同源重組機(jī)制 完成線性化后的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒之間的同源重組過程,獲得重組腺病毒?;骺仆ㄟ^自主研發(fā)對其包裝系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,提高了重組效率,縮短了構(gòu)建時間。目前基恩科構(gòu)建有腺病毒干擾系統(tǒng),腺病毒基因編輯系統(tǒng),腺病毒點(diǎn)突變系統(tǒng),及腺病毒相關(guān)產(chǎn)品,BJ5183感受態(tài),BJ5183Adeasy-1感受態(tài),腺病毒滴度測定試劑盒,特殊工藝生產(chǎn)重組效率高。基恩科包裝的腺病毒滴度高,感染效率高,用qPCR檢測病毒滴度方法可精確到病毒粒子數(shù),嚴(yán)格的質(zhì)量控制,可選擇的純化工藝超濾、超離及特殊要求的內(nèi)毒素檢測都可實(shí)現(xiàn)??蔀榭蛻籼峁┝可矶ㄖ频南俨《景b服務(wù)。
2.AdMAX腺病毒包裝系統(tǒng)
通過Cre/loxP獲得重組病毒,這個過程發(fā)生在293細(xì)胞中,從而避免在細(xì)菌中重組。將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)重組?;骺葡俨《鞠到y(tǒng)除Adeasy系統(tǒng)外,AdMax系統(tǒng)包裝也很完善,對其包裝質(zhì)粒提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,大大提高質(zhì)粒純度及濃度。以其周期短,重組效率高,病毒滴度高的優(yōu)勢成為最佳選擇包裝系統(tǒng)。
三、腺病毒包裝服務(wù)
服務(wù)產(chǎn)品 | 包裝系統(tǒng) | 產(chǎn)品類型 | 產(chǎn)品用途 |
干擾腺病毒包裝定制 | Adeasy系統(tǒng) | pAdtrack-shRNA | 表達(dá)shRNA |
AdMax系統(tǒng) | pDC316-shRNA | ||
CRISPR/Cas9腺病毒定制 | Adeasy系統(tǒng) | pAdtrack-U6-spCas9-EGFP | 基因敲除 |
AdMax系統(tǒng) | pDC316-U6-spCas9-EGFP | 基因敲除 | |
雙熒光素定制 | Adeasy系統(tǒng) | pShuttle-CMV-Luciferase | 雙熒光素 |
腺病毒現(xiàn)貨產(chǎn)品 | Adeasy系統(tǒng) | pAd-mRFP-EGFP-LC3B | 自噬 |
pAd-mRFP-LC3B | |||
pAd-EGFP-LC3B | |||
Cox8-EGFP-mCherry | |||
pShuttle-CMV-Luciferase | 雙熒光素 | ||
pAd-PE2 | 點(diǎn)突變 |
四、質(zhì)量控制
基恩科生物(GeneCarer)結(jié)合《中國藥典》,腺病毒相關(guān)疫苗中針對疫苗制劑等提出的產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的要求,同時針對細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用病毒/動物實(shí)驗(yàn)用病毒/臨床用病毒的不同需求,建立企業(yè)腺病毒產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),每一批病毒產(chǎn)品都經(jīng)過質(zhì)量部嚴(yán)格檢測,測定慢病毒的滴度、純度和各項(xiàng)生物物理指標(biāo)。
檢測項(xiàng)目 | 檢測方法 | 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考結(jié)果 |
顏色 | 肉眼判定 | 無色 |
澄清度 | 肉眼判定 | 透明,無異物 |
粘稠度 | 移液器吸取 | 無粘稠和吸液滯后現(xiàn)象 |
PH | 筆式PH計 | 7.2-7.4 |
細(xì)菌 | 平板培養(yǎng)法 | 陰性 |
真菌 | 平板培養(yǎng)法 | 陰性 |
支原體 | Nest PCR | 陰性 |
內(nèi)毒素 | 鱟試劑 | ≤50TU/mL |
有效滴度 | qPCR法 | 1*1010PFU/ml |
五、基恩科生物(GeneCarer)包裝腺病毒實(shí)例
1.Adeasy系統(tǒng)腺病毒包裝實(shí)例
Ad-mRFP-EGFP-LC3B
2.AdMax系統(tǒng)腺病毒包裝實(shí)例
Ad-EGFP-Fetub-155
六、現(xiàn)貨產(chǎn)品
基恩科生物提供腺病毒包裝定制服務(wù),不同穿梭質(zhì)粒構(gòu)建服務(wù),不同包裝系統(tǒng)所需各種質(zhì)粒,細(xì)胞,培養(yǎng)試劑等產(chǎn)品。
貨號 | 產(chǎn)品 | 滴度 | 規(guī)格 |
GC040500250 | pAdtrack-shRNA | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040500252 GC040500252 GC040500252 | pDC316-shRNA | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040600253 | pAdtrack-U6-spCas9-EGFP | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040600254 | pDC316-U6-spCas9-EGFP | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040600254 | pShuttle-CMV-Luciferase | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040100259 | pAd-mRFP-EGFP-LC3B | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040300256 | pAd-mRFP-LC3B | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040300257 | pAd-EGFP-LC3B | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040300258 | Cox8-EGFP-mCherry | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |
GC040100259 | pAd-PE2 | 1*1010PFU/ml | 8管50ul/支 |