哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，通過(guò)抗性基因篩選獲得相同表型的基因敲除細(xì)胞系，進(jìn)一步通過(guò)挑取單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)獲得基因型相同的單克隆細(xì)胞株。我們具有豐富的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除經(jīng)驗(yàn)，可為客戶提供各種細(xì)胞的基因敲除以及單克隆細(xì)胞株的篩選服務(wù)。
一、 服務(wù)內(nèi)容:
基因敲除方案的設(shè)計(jì)
CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建
CRISPR/Cas9載體敲除效率的評(píng)估
CRISPR/Cas9載體目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
基因敲除細(xì)胞系的篩選
基因敲除細(xì)胞株的篩選
基因敲除細(xì)胞系/株的鑒定
二、服務(wù)流程
三、 技術(shù)路線：
四、 交付內(nèi)容：
1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：
基因敲除載體構(gòu)建報(bào)告及測(cè)序結(jié)果
基因敲除細(xì)胞系/株篩選實(shí)驗(yàn)報(bào)告
基因敲除細(xì)胞系/株鑒定報(bào)告
2、產(chǎn)品內(nèi)容：
基因敲除載體（質(zhì)?；蚓海?br/> 基因敲除細(xì)胞系或單克隆細(xì)胞株1-2株
3、其他：
目的細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞系、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、原代細(xì)胞
構(gòu)建周期：3-4周
材料提供：基因ID號(hào)、目的細(xì)胞、一抗（WB或流式）
轉(zhuǎn)導(dǎo)方式：質(zhì)粒、慢病毒、非整合慢病毒、腺病毒
五、案例分享
圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的修復(fù)過(guò)程
1.雙gRNA/Cas9表達(dá)系統(tǒng)大片段基因敲除原理
在單gRNA/Cas9表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，再引入一個(gè)gRNA-Scaffold的表達(dá)盒，使其能夠同時(shí)表達(dá)兩個(gè)不同的gRNA靶向兩個(gè)不同的序列。因此，針對(duì)目的基因的敲除，可設(shè)計(jì)針對(duì)該基因的兩個(gè)不同靶點(diǎn)，這兩個(gè)靶點(diǎn)之間的編碼序列可以通過(guò)CRISPR/Cas-NHEJ通路完全敲除。
2.雙gRNA/Cas9介導(dǎo)的基因敲除原則
具有兩個(gè)靶點(diǎn)的雙gRNA/Cas9系統(tǒng)可以針對(duì)基因的兩個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行切割，可以有效敲除長(zhǎng)達(dá)1M的DNA序列，但是一般情況下，10kb以內(nèi)基因片段敲除非常有效，也足以滿足單個(gè)基因的敲除要求。具體設(shè)計(jì)要求如下：
2.1 如果目的基因比較小（小于10Kb或稍大于10Kb），可以設(shè)計(jì)將整個(gè)基因敲除，包括啟動(dòng)子序列；
2.2 如果目的基因很長(zhǎng)，可以選擇敲除其主要的幾個(gè)外顯子，也可以選擇敲除部分編碼序列和全部啟動(dòng)子序列；
2.3 如果有文獻(xiàn)報(bào)道目的基因的敲除，按照文獻(xiàn)敲除相同的序列和區(qū)域；3雙gRNA/Cas9介導(dǎo)的基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建
3.雙gRNA/Cas9介導(dǎo)的基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建
3.1 雙gRNA/Cas9載體的構(gòu)建
以lentiCRISPR（V2）載體為骨架，在原來(lái)的兩個(gè)BsmBI酶切位點(diǎn)引入gRNA1-Scaffold-U6-gRNA2序列構(gòu)建lentiCRISPR-Dual-Puro雙gRNA/Cas9表達(dá)載體如圖2所示：
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圖2. lentiCRISPR-Dual-Puro載體構(gòu)建原理
3.2 雙gRNA/Cas9載體基因敲除效率驗(yàn)證
（1）模式細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將293T細(xì)胞均勻的接種至12孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；注意：轉(zhuǎn)染細(xì)胞可選擇轉(zhuǎn)染效率高的293細(xì)胞，小鼠細(xì)胞可選擇MEF和3T3細(xì)胞；
（2）轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后36-48小時(shí)，消化細(xì)胞提取細(xì)胞基因組，進(jìn)行細(xì)胞基因型鑒定（PCR檢測(cè)），如果敲除的PCR條帶明顯且亮度較強(qiáng)，說(shuō)明這兩個(gè)gRNA敲除效果明顯，可用于目標(biāo)細(xì)胞的基因敲除。
B2M基因敲除雙gRNA/Cas9(lentiCRISPR-dual gRNA)圖譜
B2M基因敲除雙gRNA/Cas9載體構(gòu)建blast分析（紅色箭頭為gRNA序列）
（2）B2M基因敲除技術(shù)原理
B2M基因有4個(gè)外顯子，其中前3個(gè)外顯子為編碼序列，故在第一個(gè)外顯子上游和第三個(gè)外顯子下游設(shè)計(jì)gRNA序列，基因型PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)在兩個(gè)gRNA序列的外側(cè)如下圖所示：
（3）293T細(xì)胞B2M基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建
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如以上細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟將lentiCRISPR-dual gRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（6孔板），轉(zhuǎn)染后48小時(shí)更換抗生素篩選培養(yǎng)液（2.5ug/ml嘌呤霉素），連續(xù)篩選5天，對(duì)照組細(xì)胞已完全凋亡，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞逆抗性增殖擴(kuò)增。分離部分細(xì)胞，裂解，PCR檢測(cè)結(jié)果如下：
如上圖293T細(xì)胞B2M基因敲除基因型檢測(cè)，野生型條帶4.6Kb未檢測(cè)到，敲除型條帶為467bp，經(jīng)膠回收連接pMD18T載體，測(cè)序確定B2M基因的1、2和3外顯子被完全敲除（如下圖2個(gè)陽(yáng)性T克隆的比對(duì)分析）。
293T細(xì)胞B2M基因敲除測(cè)序分析