siRNA（short/small interfering RNAs），siRNA有時稱為短干擾RNA或沉默RNA，siRNA是一種長20到25個核苷酸的雙鏈RNA，目前已知siRNA主要參與RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達。此外，也參與一些與RNAi相關(guān)的反應途徑，例如抗病毒機制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。
siRNA的結(jié)構(gòu)示意圖
外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（dsRNA）被RNaseIII（例如Dicer）切割成約21-25nt具有活性的siRNA結(jié)構(gòu)。隨后，Dicer將在RNA結(jié)合蛋白TRBP的幫助下將雙鏈siRNA加載到Argonaute（AGO2）蛋白，形成復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。然后，siRNA將解開雙鏈，其反義鏈與靶mRNA結(jié)合后，AGO2將特異性降解靶mRNA，從而抑制其翻譯。最后，被切除的靶mRNA被釋放，RISC被回收，使用相同的加載引導鏈再進行幾輪靶向降解。此外，siRNA可以在RNA聚合酶的作用下再次形成dsRNA，從而重新參與以上過程。
RISC中發(fā)揮沉默靶基因作用的主要部分是Argonaute蛋白（AGO2）。為了實現(xiàn)siRNA介導的沉默，AGO2需要連接siRNA反義鏈，切掉隨從鏈，隨后在保持與反義鏈結(jié)合的情況下，經(jīng)歷多個靶mRNA識別、切割和釋放循環(huán)。AGO2具有三個功能域，PAZ、MID和PIWI，其中PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNaseH樣的折疊情況，是賦予其切割活性的功能域。PAZ結(jié)構(gòu)域具有RNA結(jié)合作用，能夠識別單鏈RNA的3’端，起到了鉚定向?qū)ф湹?’端的作用，5'端則插入MID和PIWI結(jié)構(gòu)域之間，從而便于PIWI結(jié)構(gòu)與實現(xiàn)切割功能。
二、siRNA的設計原則
siRNA是否能起到特異性沉默目的基因作用，siRNA序列的設計，是關(guān)鍵的因素之一，或者說是最重要的因素。
以下是設計siRNA遵循的一般原則和步驟：
1. 確定靶基因，并針對靶基因序列進行一些簡單的生信分析，了解該mRNA轉(zhuǎn)錄本的基本結(jié)構(gòu)信息，及這個基因的不同轉(zhuǎn)錄本，基因或基因上SNP位點多態(tài)性，功能域等一些基礎信息；并針對該基因，查詢相關(guān)數(shù)據(jù)庫，看是否有已驗證過的siRNA序列。有則盡量優(yōu)先用驗證有效的序列，沒有則自行設計；
2. 一般首選靶基因的CDS區(qū)域作為siRNA的同源區(qū)，其次才選擇3’UTR；一般不建議選擇5’UTR；
3. siRNA堿基組成方面，一般建議GC含量在（30-52%），并避免單堿基連續(xù)4個以上的重復區(qū)域，一般選擇AA開始區(qū)域（這樣對應的反義鏈以uu作為3’末端）；
4. 如果直接合成siRNA，則注意退火后的siRNA是5’縮進，3’突出的；一般是突出2個堿基；
5. 序列內(nèi)部（即siRNA核心序列）避免穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)；
6. 候選siRNA區(qū)域確定后，還需要對本種屬做對庫搜索，避免與其它基因同源；
7. 一個靶基因，需要選定3-5個合格的siRNA位點供篩選；即需要合成3-5套siRNA或構(gòu)建3-5個shRNA載體；
8. 一般還需要提供一個陰性對照（陰性對照最好是與siRNA序列堿基組成相似但與靶基因及種屬其它基因沒有同源性）；最好還有一個陽性對照（陽性對照選用同種屬其它靶基因已驗證過的siRNA序列）。
三、siRNA的體外定制-化學合成siRNA
siRNA便宜且實用，可作為我們預實驗或?qū)嶒灣跗诘某Ｒ?guī)工具。合成siRNA應用廣泛，這種方法的得率和純度都比較高。對合成siRNA還可以進行一系列化學修飾以提高siRNA的穩(wěn)定性、降低脫靶效應，以及（或者）阻止激活天然免疫反應。在用于細胞之前，合成的正義和反義siRNA需在體外復性形成雙鏈siRNA。
基恩科（Genecarer）生物RNAi的服務包括單條siRNA定制、三保一套餐（定制三條siRNA且保證其中至少一條能夠?qū)崿F(xiàn)良好的敲減效果）、四保一套餐等。由于siRNA有一定的脫靶率，且其敲減效率可能與具體的靶向序列有一定關(guān)系，因此，除非有在可靠文獻上找到詳細的siRNA序列，否則，建議直接選擇三保一或四保一套餐。
通過在NCBI上查詢了需要敲減的目的基因的CDS序列或是基因ID或是NM號之后，設計siRNA，確認無誤后項目立項，5-7天即可合成一套成品siRNA。
以三保一套餐為例，會收到4個siRNA：
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套餐組成 |
交付內(nèi)容介紹 |
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靶基因siRNA oligos |
根據(jù)目的基因，設計合成3-4對siRNA。 |
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陰性對照 siRNA oligos |
陰性對照為靶細胞無同源性的siRNA，一個嚴謹?shù)腞NAi實驗，陰性對照是必不可少的。 |
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陽性對照 siRNA |
一般為內(nèi)參基因GAPDH的有效siRNA，用以檢測實驗過程中各操作步驟的可靠性。 |
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FAM熒光標記陰性對照siRNA Oligos |
帶熒光基團的陰性對照，主要用于預實驗檢測目的細胞siRNA的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后6-12 通過熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率。 |
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陰性對照 |
正義鏈 |
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT |
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反義鏈 |
ACGUGACACGUUCGGAGAATT |
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陽性對照 |
正義鏈 |
AGAAUGGGAAGCUUGUCAUCAATT |
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反義鏈 |
UUGAUGACAAGCUUCCCAUUCUTT |
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陽性對照 |
正義鏈 |
GUAUGACAACAGCCUCAAGTT |
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反義鏈 |
CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT |
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陽性對照 |
正義鏈 |
GUAAAGACCUCUAUGCCAATT |
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反義鏈 |
UUGGCAUAGAGGUCUUUACTT |
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四、siRNA的存儲與溶解
siRNA儲存
siRNA以凍干粉的形式常溫運輸。建議在-20℃或-80℃儲存，可分裝保存，避免反復凍融。FAM,CY3,CY5等熒光標記的siRNA棕色離心管避光保存。
siRNA溶解
siRNA是凍干粉，附在管壁上，所以開蓋前請先離心，再小心打開管蓋，溶解后蓋上管蓋振蕩； 并嚴格遵循RNA操作規(guī)則，使用RNase-free的實驗耗材進行實驗操作，避免RNA降解。使用時最好于冰上放置；