Seahorse 細(xì)胞能量代謝利用高靈敏度的細(xì)胞外氧氣與H+流量變化檢測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)完成細(xì)胞內(nèi)兩條主要能量產(chǎn)生途徑 —— 線粒體呼吸和糖酵解的測(cè)量，借助全自動(dòng)藥物加注裝置，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞外酸化率 （ECAR： Extracellular Acidificarion Rate ） 和氧氣消耗速率 （OCR： Oxygen Consumption Rate ）可以測(cè)得細(xì)胞有氧呼吸與糖酵解的基礎(chǔ)水平、最高 / 最低水平及能量?jī)?chǔ)備水平，從而繪制出完整的 " 壓力曲線 " ，作為細(xì)胞能量代謝的黃金標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、免疫學(xué)研究、干細(xì)胞研究、藥物發(fā)現(xiàn)與篩選等多個(gè)方向。
一、細(xì)胞能量代謝服務(wù)
1. 檢測(cè)項(xiàng)目：直接測(cè)定各種代謝模式氧氣消耗速率OCR和細(xì)胞外酸化率 Ecar 值，間接反應(yīng)基礎(chǔ)代謝率、最大呼吸率、呼吸儲(chǔ)備能力、質(zhì)子漏水平、產(chǎn)氧自由基、葡萄糖代謝、糖酵解能力、糖酵解儲(chǔ)備能力、非糖酵解酸化等。
2. 主要檢測(cè)樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、分離線粒體、組織微球等。
3. 檢測(cè)周期： 1-3天
二、細(xì)胞能量代謝實(shí)驗(yàn)服務(wù)主要優(yōu)勢(shì)：
1. 專(zhuān)業(yè)的團(tuán)隊(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；
2. 試劑耗材充足，滿足各種實(shí)驗(yàn)需求，結(jié)果 可靠迅速；
3. 嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。
三、線粒體壓力測(cè)試介紹：
線粒體壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)通過(guò)依次加入線粒體電子傳遞鏈（ETC）的靶向藥物測(cè)量細(xì)胞的氧氣消耗速率（ OCR ）而得到反映線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。該實(shí)驗(yàn)使用的藥物為 oligomycin 、 FCCP 、 rotenone/antimycinA ，加入順序及 ETC 靶點(diǎn)如圖 2 ，藥物作用原理如圖 1 ：
Oligomycin ：該藥物抑制ATP合酶（即復(fù)合物 Ⅴ ），在測(cè)量細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸后第一個(gè)加入，該藥可以影響或降低通過(guò) ETC 的電子流，引起線粒體呼吸或 OCR 減少，這部分減少的 OCR 與細(xì)胞 ATP 合成相關(guān)。
FCCP ：該藥在oligomycin后加入，是一種解偶聯(lián)劑，加入該藥會(huì)破壞質(zhì)子梯度和線粒體膜電位，引起電子在 ETC 不受限制地傳遞，同時(shí)復(fù)合物 Ⅳ 的耗氧達(dá)到最大。 FCCP 刺激的 OCR 可被用來(lái)計(jì)算細(xì)胞備用呼吸能力（該值為最大呼吸與基礎(chǔ)呼吸的差值），備用呼吸能力代表細(xì)胞對(duì)能量需求增加或在壓力下作出反應(yīng)的能力。
Rotenone/AntimycinA ：第三次加入的藥物，是rotenone和 antimycinA 的混合物。 Rotenone 是復(fù)合物 Ⅰ 的抑制劑， antimycinA 是復(fù)合物 Ⅲ 的抑制劑。這兩種藥物可關(guān)閉線粒體呼吸，從而能夠計(jì)算出由線粒體之外活動(dòng)所驅(qū)動(dòng)的非線粒體呼吸耗氧。
圖1： 線粒體電子傳遞鏈
圖2：標(biāo)準(zhǔn)OCR曲線
四、線粒體壓力測(cè)試主要測(cè)量指標(biāo)：
非線粒體耗氧量（Non-mitochondrial Respirarion）：加入 rotenone 和 antimycinA 后仍持續(xù)的耗氧，這是由一部分細(xì)胞酶繼續(xù)耗氧產(chǎn)生的，該參數(shù)對(duì)于精確測(cè)量線粒體呼吸功能非常重要。
基礎(chǔ)呼吸速率（Basal Respirartion）：用于滿足細(xì)胞的 ATP 需求和質(zhì)子漏的耗氧，代表細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下的能量需求。
ATP產(chǎn)生量（ ATP Production ） : 加入 oligomycin 后產(chǎn)生的耗氧下降部分，占基礎(chǔ)呼吸耗氧的一部分，用于驅(qū)動(dòng) ATP 合成，代表線粒體滿足細(xì)胞能量需求的 ATP 合成能力。
最大呼吸速率（Maximal respiration）：加入 FCCP 后獲得的細(xì)胞最大耗氧， FCCP 通過(guò)刺激細(xì)胞呼吸鏈以最大能力工作，來(lái)模擬一種生理上的 “ 能量需求 ” ，這引起了底物（糖、脂肪、氨基酸）的快速氧化以應(yīng)對(duì)這種代謝挑戰(zhàn)，代表了細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)的最大呼吸速率。
呼吸儲(chǔ)備能力（Spare Capacity ）：最大呼吸減去基礎(chǔ)呼吸的耗氧，代表細(xì)胞對(duì)能量需求的潛在響應(yīng)能力以及細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸與理論呼吸最大值間的差距，細(xì)胞響應(yīng)需求的能力可作為細(xì)胞適應(yīng)性或靈活性的指標(biāo)。
質(zhì)子漏（H+（ Proton) Leak ）：基礎(chǔ)呼吸減去 ATP 相關(guān)呼吸的剩余耗氧，該部分氧氣消耗未偶聯(lián) ATP 合成。質(zhì)子漏可作為線粒體損傷的標(biāo)志，也可被認(rèn)為是調(diào)節(jié)線粒體 ATP 合成的一種機(jī)制。
藥物 | 作用 | 對(duì)OCR 的影響 |
oligomycin | 線粒體 ATPase 抑制劑 | 降低 |
FCCP | 通過(guò)消耗細(xì)胞內(nèi)ATP 而成為線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)劑 | 升高 |
Rotenone | 線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I 抑制劑。 | 降低 |
antimycin A | 線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物III 抑制劑 | 降低 |
案例分析1： CD4+ T 細(xì)胞Ocar測(cè)定
圖3: CD4+ T細(xì)胞 OCR 測(cè)定
非線粒體耗氧量 | 9.7 |
基礎(chǔ)呼吸速率 | 14.9 |
ATP產(chǎn)生量 | 14.7 |
最大呼吸速率 | 63.7 |
呼吸儲(chǔ)備能力 | 48.8 |
質(zhì)子漏 | 0.2 |
藥物終濃度 | Oligomycin： 1.5 μM ； FCCP ： 3um ， rotenone/antimycin A ： 5uM |
細(xì)胞數(shù)量 | 4×105個(gè) |
使用儀器 | Seahorse XFp |
通道數(shù) | 8通道 |
細(xì)胞粘附劑 | Cell-Talk |
試劑盒 | Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit |
五、糖酵解壓力測(cè)試介紹：
葡萄糖在胞漿中轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸，并向細(xì)胞外環(huán)境中釋放質(zhì)子，引起胞外環(huán)境的酸化，本實(shí)驗(yàn)即測(cè)量細(xì)胞的胞外酸化率（ECAR ）。需要注意，糖酵解壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)液中沒(méi)有 glucose 和 pyruvate ，因此配制檢測(cè)液時(shí)勿加入這兩種底物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)依次加入 glucose 、 oligomycin 和 2-DG 來(lái)得到反映細(xì)胞糖酵解功能的參數(shù)如（ 圖4 ）。
圖4： 葡糖糖代謝和標(biāo)準(zhǔn)的ECAR曲線
Glucose ：實(shí)驗(yàn)第一次加入的藥物是飽和濃度的葡萄糖，細(xì)胞通過(guò)糖酵解途徑利用該葡萄糖并將其分解為丙酮酸，產(chǎn)生 ATP 、 NADH 、水和質(zhì)子。質(zhì)子釋放入胞外環(huán)境引起 ECAR 的迅速升高，這種由葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答被稱為細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的糖酵解能力。
Oligomycin：實(shí)驗(yàn)第二次加入的藥物為 oligomycin ， ATP 合酶的抑制劑，可抑制線粒體 ATP 產(chǎn)生，從而將能量產(chǎn)生轉(zhuǎn)移至糖酵解通路，引起 ECAR 進(jìn)一步升高，反映了細(xì)胞最大的糖酵解能力。
2-DG（ 2-deoxy-glucose ）： 2-DG 是最后加入的藥物，該藥通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合糖酵解途徑的己糖激酶而抑制糖酵解，引起 ECAR 降低從而證實(shí)實(shí)驗(yàn)中 ECAR 的產(chǎn)生來(lái)源于糖酵解途徑。 
六、糖酵解壓力測(cè)試主要測(cè)量指標(biāo)：
糖酵解（ Glycolysis ）：葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)中加入飽和濃度葡萄糖后細(xì)胞達(dá)到的 ECAR 值，反映細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的糖酵解能力。
糖酵解能力 （Glycolytic capacity）：加入 oligomycin 后，細(xì)胞達(dá)到的最大 ECAR 值，指 oligomycin 有效關(guān)閉了氧化磷酸化功能后，迫使細(xì)胞利用糖酵解達(dá)到的最大產(chǎn)生能量的能力。
糖酵解儲(chǔ)備 （Glycolytic Reserve）： Glycolytic capacity 與 Glycolysis 的差值，反映了細(xì)胞滿足能量需求的能力，以及糖酵解功能與細(xì)胞理論最大值之間的接近程度。
非糖酵解的酸化 （Non-glycolytic acidification ）：細(xì)胞外酸化的其他來(lái)源，非來(lái)自糖酵解途徑。
案例分析1： AGS 腫瘤細(xì)胞 ECAR 測(cè)定
圖5： AGS腫瘤細(xì)胞 ECAR 測(cè)定
葡萄糖代謝 | 83.5 |
糖酵解能力 | 103.9 |
糖酵解儲(chǔ)備能力 | 20.4 |
非糖酵解酸化率 | 22.0 |
藥物終濃度 | Glucose： 10 mM ； Oligomycin ： 1.5 μM ； 2-DG ： 50 mM |
細(xì)胞數(shù)量 | 1×104個(gè) |
使用儀器 | Seahorse XFp |
通道數(shù) | 8通道 |
細(xì)胞粘附劑 | 無(wú) |
試劑盒 | Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit |