采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行目的基因（外源基因，抗性基因和熒光標(biāo)志等）的定點(diǎn)敲入，是通過(guò)提供外源模板（Donor載體）依靠細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制NHEJ（非同源末端連接）和HDR（同源同組）完成的。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的NHEJ對(duì)標(biāo)記基因的插入概率明顯高于HDR修復(fù)機(jī)制。我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)在以NHEJ介導(dǎo)的目的基因敲入細(xì)胞株構(gòu)建中具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，可實(shí)現(xiàn)敲入概率30%以上，通過(guò)抗性篩選后的基因敲入概率可達(dá)80%以上。
一、服務(wù)內(nèi)容:
基因敲入細(xì)胞系/株的鑒定基因敲入的實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)
CRISPR/Cas9和Donor敲入載體的構(gòu)建
CRISPR/Cas9載體效率的評(píng)估
CRISPR/Cas9和Donor載體目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
基因敲入細(xì)胞系的篩選
基因敲入細(xì)胞株的篩選
基因敲入細(xì)胞系/株的鑒定
二、服務(wù)流程:
三、技術(shù)路線：
四、 交付內(nèi)容：
1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：
基因敲入載體和donor載體構(gòu)建報(bào)告及測(cè)序結(jié)果
基因敲入細(xì)胞系/株篩選實(shí)驗(yàn)報(bào)告
基因敲入細(xì)胞系/株鑒定報(bào)告
2、產(chǎn)品內(nèi)容：
基因敲入載體（質(zhì)?；蚓海?/span>
基因敲入細(xì)胞系或單克隆細(xì)胞株1-2株
五、案例分享
案例1：293T-AAVS1-Cas9細(xì)胞株
293T-AAVS1-Cas9細(xì)胞株是采用CRISPR技術(shù)介導(dǎo)的基因同源重組構(gòu)建的，基因插入位點(diǎn)位于人PPP1R12C基因的第一個(gè)內(nèi)含子上（AAVS1位點(diǎn)）。在該位點(diǎn)中插入外源基因片段具有穩(wěn)定表達(dá)、不影響其他基因轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)。與慢病毒感染技術(shù)相比，AAVS1位點(diǎn)基因插入穩(wěn)定表達(dá)，可以有效控制目的基因表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)目的基因單、雙拷貝以及細(xì)胞生理水平表達(dá)等，彌補(bǔ)慢病毒感染細(xì)胞中目的基因表達(dá)拷貝數(shù)不確定，表達(dá)水平不可控的缺點(diǎn)。
1.1 293T-AAVS1-Cas9細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)路線
pspCas9-AAVS1-gRNA和pUC-AAVS1-spCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，通過(guò)嘌呤霉素持續(xù)篩選獲得具有抗性細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，最終通過(guò)基因組和蛋白質(zhì)鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞株，即293T-AAVS1-Cas9細(xì)胞株。技術(shù)路線如下圖：
1.2 Cas9蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)株產(chǎn)品特點(diǎn)：
穩(wěn)定表達(dá)spCas9蛋白
單克隆細(xì)胞株
基因切割效率穩(wěn)定
使用只需轉(zhuǎn)染gRNA
CRISPR修飾文庫(kù)篩選
1.3 293T-AAVS1-Cas9細(xì)胞株WB鑒定
1.4 Cas9穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株現(xiàn)貨
名稱(chēng) | 介紹 |
293T-Cas9 | 293T細(xì)胞基因插入Cas9核酸酶基因，穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白 |
293T-Cas9Nick | 293T細(xì)胞基因插入Cas9Nick核酸酶基因，穩(wěn)定表達(dá)Cas9nick蛋白 |
Hela-Cas9 | Hela細(xì)胞基因插入Cas9核酸酶基因，穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白 |
Hela-Cas9Nick | Hela細(xì)胞基因插入Cas9Nick核酸酶基因，穩(wěn)定表達(dá)Cas9nick蛋白 |
案例2: Hul-7 Cells-A gene-3UTR-ires-GFP細(xì)胞株
Hul-7 細(xì)胞A基因3‘UTR區(qū)域插入IRES-GFP序列，通過(guò)切口末端拼接的方式將GFP插入到目的基因的3‘UTR區(qū)域，雙gRNA系統(tǒng)，Cas9/gRNA 1介導(dǎo)基因組目的片段切割，Cas9/gRNA 2介導(dǎo)Donor載體，雙載體共轉(zhuǎn)染Hul-7細(xì)胞，流式細(xì)胞分選GFP+細(xì)胞，單克隆收集并鑒定。
2.1 Hul-7 Cells-A gene-3UTR-ires-GFP細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)路線
Hul-7 Cells-A gene-3UTR-ires-GFP細(xì)胞基因型和表型鑒定
流式細(xì)胞分選單克隆細(xì)胞并收集在24孔板，左圖為流式分選圖，右圖為單克隆細(xì)胞顯微成像圖和擴(kuò)增后PCR鑒定圖譜。
2.2 基因插入細(xì)胞系現(xiàn)貨