miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度為20-24nt，miRNA可能來自于Pre-mRNA的內(nèi)含子或者基因組的基因間隔區(qū)中。
一、miRNA的成熟
RNA酶IIIDrosha-DGCR復合體首先在細胞核中將miRNA原代初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-mRNA）基部切割雙鏈形成60-70個核苷酸的3C末端具有二核苷酸突出（Over-hang）,5C末端具有磷酸基的莖環(huán)中間體，即前體miRNA（Pre-miRNA）。然后，通過識別pre-miRNA的3C端的二核苷酸突出信號，轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5與pre-miRNA結(jié)合，將pre-miRNA通過依賴Ran-GTP途徑運輸至細胞質(zhì)。最后，Dicer識別pre-miRNA雙鏈的3C末端突出以及5C末端磷酸，切斷距莖環(huán)大約2個螺旋轉(zhuǎn)角的螺旋體的雙鏈，其產(chǎn)物結(jié)構類似于siRNA的二聚體，其中pre-miRNA的一條臂產(chǎn)生一個長度與miRNA相同的片段，即miRNA，而成熟的miRNA來自于pre-miRNA的另一條臂。在經(jīng)過核質(zhì)轉(zhuǎn)運及切割后，RNA解螺旋酶作用于miRNA：miRNA二聚體，其中miRNA被降解，miRNA則進入RNA誘導的沉默復合物（RISC）中發(fā)揮作用。
二、miRNA的主要特征
1.miRNA定位于能潛在編碼其前體發(fā)夾結(jié)構的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)域。
2.在3C端有1-2個長度的變化，通常長度為21-25nt。
3.Dicer酶從折疊的發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄前體的一條臂上切割得到成熟的miRNA
4.成熟的miRNA序列和預測的發(fā)夾結(jié)構在不同物種間具有高度的進化保守性。
三、miiRNA的主要功能
1.miRNA指導靶mRNA的切割。
在植物中，miRNA主要進入RNA干涉途徑以降解靶分子，因為大多數(shù)植物miRNA與靶序列ORF（開放閱讀框）完全匹配。miRNA的靶分子位于PIWI結(jié)構域中，而其3C末端位于PAZ結(jié)構域的親水性結(jié)構域內(nèi)，兩者互相識別互補后，RNA水解酶作用于靶分子中與miRNA的第12或第11堿基所對應的殘基的磷酸鍵，降解靶分子5C端序列
2. miRNA對靶序列進行翻譯抑制。
哺乳動物中，靶序列通常于mRNA的3’UTR互補結(jié)合，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。
四、miRNA的體外調(diào)控
1.miRNA過表達的方式主要有2種：
a、合成miRNA mimics ，化學合成的miRNA mimics是雙鏈RNA分子，轉(zhuǎn)染至細胞后模擬內(nèi)生miRNA發(fā)揮作用。
b、表達Pre-miRNA序列，以及兩邊側(cè)翼序列，模擬體內(nèi)miRNA生成，通過質(zhì)粒、慢病毒、腺病毒、AAV病毒等表達，并在細胞模型或體內(nèi)生成成熟的miRNA
2.miRNA抑制表達的方式主要有3種：
A、反義核苷酸，通過化學合成inhibitor或通過載體或病毒表達miRNA成熟體的反義序列，，一般通過pol III 啟動子U6或H1表達，下調(diào)miRNA。但是檢測無法直接通過QPCR檢測，只能通過靶基因表達進行檢測。
B、CRISPR/Cas9 方法，通過CRISPR/Cas9對生成miRNA的基因組序列進行編輯，sgRNA可以設計在成熟miRNA位置或前體莖環(huán)結(jié)構位置，達到破壞pre-miRNA或成熟miRNA的目的，主要優(yōu)點是可以直接通過QPCR檢測。
C、達豐度，缺點是收到PAM的限制，不一定存在合適的sgRNA。
D、Sponge海綿體，海綿體的應用是參考LncRNA和CirRNA與miRNA相互作用方式進行設計，將4-10 個miRNA結(jié)合位點串聯(lián)的表達框，通過II啟動子表達在GFP/cherry等基因的3UTR區(qū)域，并在RISC切割位點設計幾個錯配堿基，避免mRNA在吸附miRNA的同時被Ago2介導的核酸內(nèi)切酶RNase H酶降解，讓miRNA遠離天然的mRNA靶位點從而出現(xiàn)功能缺失。
| miRNA抑制方式 |
優(yōu)點 |
缺點 |
是否組織特異性表達 |
QPCR檢測 |
| 反義核苷酸 |
合成方便，設計方便 |
無法對富含連續(xù)T的miRNA進行敲降 |
否 |
否 |
| CRISPR/Cas9 |
靶向miRNADNA， |
miRNA短，sgRNA設計限制 |
否 |
是 |
| Sponge海綿體 |
長效持續(xù)表達，可以同時抑制不同miRNA，適合組織特異性表達 |
沒有真正降解miRNA，抑制效果受miRNA表達豐度影響 |
是 |
否 |
Hong Chang等通過CRISPR/Cas9對miR-17、miR-200c 和 miR-141 進行敲低，均實現(xiàn)了目的miRNA不同程度的敲低。
圖a:CRISPR/Cas9 敲低miRNA作用原理 圖b-d miR-17 miR-200c miR-141 sgRNA設計
QPCR檢測miR-17 miR-200c miR-141敲降水平
| miRNA過表達 |
miRNA抑制 |
| miRNA mimics合成 |
miRNA inhibitor合成 |
| miRNA 化學修飾mimics 合成 |
miRNA 化學修飾inhibitor合成 |
| miRNA mimics LNP包裹 |
miRNA inhibitor LNP包裹 |
| miRNA過表達載體構建 |
miRNA抑制表達載體構建 |
| miRNA過表達慢病毒包裝 |
miRNA抑制表達慢病毒包裝 |
| miRNA過表達腺病毒包裝 |
miRNA抑制表達腺病毒包裝 |
| miRNA 過表達AAV病毒包裝 |
miRNA 抑制表達AAV病毒包裝 |
| miRNA過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構建 |
miRNA抑制穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構建 |
| miRNA 過表達與靶基因雙熒光素酶實驗 |
miRNA 抑制與靶基因雙熒光素酶實驗 |
