北海道大學(xué)藥學(xué)院創(chuàng)新納米醫(yī)學(xué)實驗室開發(fā)了一種新型脂質(zhì)組合，該組合可以有效且高度選擇性地將質(zhì)粒DNA (pDNA)遞送至脾臟中的免疫細(xì)胞。使用DODAP（一種以前被認(rèn)為對于基因傳遞效率低下的可電離脂質(zhì)），首次證明，這種被忽視的脂質(zhì)可以成功地用于體內(nèi)高效和靶向基因傳遞，當(dāng)與DOPE組合（一種特定的輔助脂質(zhì)；使用一定的DODAP和DOPE比例可形成脂質(zhì)納米顆粒(LNP)，其基因表達(dá)量提高約1000倍，并且這種表達(dá)對脾臟具有特異性，使其成為使用pDNA轉(zhuǎn)染時最具脾臟選擇性的系統(tǒng)。開發(fā)的DODAP/DOPE-LNP通過補體C3 受體靶向脾臟中的免疫細(xì)胞，該途徑對于有效的基因表達(dá)至關(guān)重要。作者推測 DODAP/DOPE-LNP的高脾臟轉(zhuǎn)染活性是通過補體受體促進(jìn)與B細(xì)胞激活相關(guān)的基因表達(dá)引起的。包封腫瘤抗原編碼pDNA的LNP顯示出預(yù)防性和治療性抗腫瘤作用。優(yōu)化后的LNP可產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子和抗原特異性抗體，并發(fā)揮抗原特異性細(xì)胞毒作用。這項研究復(fù)興了 DODAP在基因遞送中的應(yīng)用，并強調(diào)了使用適當(dāng)?shù)闹|(zhì)組合將基因遞送至特定細(xì)胞的重要性。

       而脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 是將治療性核酸（例如短干擾RNA (siRNA)、信使RNA (mRNA) 和質(zhì)粒DNA (pDNA)）遞送至患病組織和細(xì)胞內(nèi)作用位點的先進(jìn)技術(shù)之一。用于體內(nèi)基因遞送的有效LNP由可電離的陽離子脂質(zhì)、磷脂、膽固醇 (Chol) 和聚乙二醇 (PEG) 脂質(zhì)組成。當(dāng)使用基于脂質(zhì)的載體時，可電離的陽離子脂質(zhì)是有效核酸遞送的關(guān)鍵。最早的傳統(tǒng)可電離脂質(zhì)，如 1,2-二油?；?3-二甲基銨丙烷 (DODAP) 和 1,2-二油?；?N,N-二甲基-3-氨基丙烷 (DODMA)，是為了克服與永久電離相關(guān)的缺點而開發(fā)的。陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的帶正電荷的化合物。使用這些可電離的脂質(zhì)，可以有效地封裝核酸并提供在生理pH值下具有接近中性電荷的LNP，由于其內(nèi)體逃逸效率低，用于siRNA 遞送的成功有限。人們合成了各種類型的可電離脂質(zhì)，目的是通過改變早期可電離脂質(zhì) DODAP 和 DODMA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)來提高基因沉默效力。合成了一種高效脂MC3，它是第一個siRNA藥物Patisiran的主要成分。

         DNA的疫苗目前引起了人們的濃厚興趣，因為與傳統(tǒng)的肽疫苗相比，它們具有多種優(yōu)勢，包括快速且可重復(fù)的大規(guī)模生產(chǎn)，以及易于儲存和運輸。pDNA遞送對于癌癥疫苗特別有前景，它具有通過表達(dá)癌癥抗原誘導(dǎo)抗原呈遞和激活免疫細(xì)胞的潛力，并且其內(nèi)在的佐劑作用導(dǎo)致觸發(fā)細(xì)胞免疫。脾臟是基因疫苗靶器官的良好候選者，它含有多種類型的免疫細(xì)胞，可賦予先天性和適應(yīng)性免疫。大多數(shù)靜脈注射的含有包封核酸的LNP輸送到肝臟和脾臟被降解，藥物遞送研究人員在將核酸輸送到其他器官時通常專注于避免肝臟和脾臟的攝取。事實上，肝臟和脾臟是臨床應(yīng)用基因治療的候選器官。

1.體內(nèi)DODAP-LNPs 基因的高表達(dá)

       作者做了Raw264.7細(xì)胞和小鼠動物實驗來確定靶向脾臟的LNP，將YSK05-LNP與DODAP-LNPs做了對比。

結(jié)果表明：

(1)DODAP-LNPs轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞的效果低于YSK05-LNP(圖1A)。

(2)DODAP-LNPs轉(zhuǎn)染小鼠器官的效果高于YSK05-LNP，DODAP-LNPs具有較高的脾靶向能力(圖1B)。

(3)進(jìn)一步了解DODAP-LNP體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果好的原因，做了兩種LNP的表征分布（表1）。熒光素酶活性除以遞送到每個組織的LNP量來計算基因表達(dá)效率。結(jié)果表明YSK-LNP優(yōu)先遞送至脾臟，遞送量高于DODAP-LNP 。DODAP-LNP遞送到肝臟的量高于脾臟(圖1C)。

(4)生物分布結(jié)果不能解釋YSK05-LNPs和DODAP-LNPs之間活性的差異。DODAP-LNPs在脾臟中的基因表達(dá)效率顯著高于YSK05-LNPs。DODAP-LNPs是靶向脾臟的最佳候選(圖1D)。

圖1.YSK05-和DODAP-LNPs體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染活性的比較

2.DODAP-DOPE 組合是LNP靶向脾臟的關(guān)鍵因素

        作者驗證輔助脂質(zhì)（DOPE）可能是 DODAP-LNP 的重要組成部分，選擇（DOPE、二油酰磷酸膽堿（DOPC）或1-棕櫚酰-2-油酰磷酸乙醇胺（POPE））制備了不同的DODAP-LNP。做了熒光素酶活性和生物分布實驗。

結(jié)果表明:

（1）DOPE的LNP轉(zhuǎn)染活性最高，脾臟靶向性最好(圖2A)。

（2）三種LNP之間在脾臟遞送量沒有顯著差異(圖2B)。

（3）DODAP/DOPE組合在脾臟中基因表達(dá)效率遠(yuǎn)高于DODAP/POPE或DODAP/ DOPC， DODAP/POPE次之(圖2C)。

圖2.使用不同輔助脂質(zhì)和不同脂質(zhì)比例制備的不同LNP的轉(zhuǎn)染活性比較。

3.DODAP和DOPE的比例影響基因表達(dá)

       作者對比了DODAP/DOPE 比率對LNP功能的影響，使用不同的DODAP/DOPE比例制備了不同的LNP。

結(jié)果表明：

（1）對比了DODAP/DOPE比例在 35/50 至 60/25 范圍內(nèi)的影響發(fā)現(xiàn)與肝臟和肺臟相比，所有比例的LNP在脾臟都顯示出最高活性，但隨比例增加活性降低（圖 2D）。

(2)比較了活性差異最大比例LNP的生物分布（DODAP/DOPE = 35/50 與 60/25），發(fā)現(xiàn)兩中LNP生物分布無明顯差異，但比例較低LNP的基因表達(dá)效率高（圖 2E,F）。

(3)驗證了DODAP/DOPE更廣泛比例的活性，脾臟活性在15/70至35/50范圍內(nèi)達(dá)到上限， 15/70比率是脾/肝的最大活性比（圖2G）。以上數(shù)據(jù)表明 DODAP 和 DOPE 的組合是LNP靶向脾臟的重要因素。為了擴大LNP的制備規(guī)模并獲得更好的pDNA封裝效率，比較了脂質(zhì)膜水合與乙醇稀釋。稀釋法制備的LNP負(fù)電荷較低，pDNA封裝較高，LNP更加均一（表2）。

圖2.使用不同輔助脂質(zhì)和不同脂質(zhì)比例制備的不同LNP的轉(zhuǎn)染活性比較

4.驗證靶向脾的LNP增強基因表達(dá)

         作者使用離體成像檢查了包括淋巴結(jié)在內(nèi)的不同器官中的分布和基因表達(dá)（熒光素酶活性），確定乙醇稀釋法制備的DODAP-DOPE-LNP靶向脾增強基因表達(dá)。

結(jié)果表明：

       LNP主要分布在肝臟、肺和脾中。淋巴結(jié)在內(nèi)的其他器官中觀察少量熒光。脾臟顯示出高基因表達(dá)，這證實了優(yōu)化的LNP靶向脾增強了轉(zhuǎn)染活性。

 

5.DODAP-DOPE-LNP 在抗原呈遞細(xì)胞中的分布

       作者檢測了LNP分布到脾細(xì)胞的類型，確定基因高效表達(dá)的機制。使用特異性抗體來確定分布的脾細(xì)胞類型（T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC 和巨噬細(xì)胞）

結(jié)果表明：

(1)優(yōu)化后的DODAP-DOPE-LNPs主要分布于APC（抗原呈遞細(xì)胞），如巨噬細(xì)胞、DC和B細(xì)胞。大部分熒光分布在B細(xì)胞（圖4A）。

（2）DiD標(biāo)記陽性細(xì)胞，90%巨噬細(xì)胞呈陽性，60%的B細(xì)胞呈陽性，40%的DC細(xì)胞呈陽性（圖4B）。

（3）將LNP封裝好的DNA注射到小鼠體內(nèi)，收集脾臟，分離每種細(xì)胞測量熒光素酶活性（代表每個細(xì)胞的基因表達(dá)）。DODAP-LNP不轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，但有可能轉(zhuǎn)染其他APC（圖4C）。

（4）作者計算每種細(xì)胞類型的總基因表達(dá)量，脾臟中每種細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)量（脾臟中每種細(xì)胞類型的百分比；T細(xì)胞：20-30%，B細(xì)胞：50-60% ，樹突細(xì)胞：5%，巨噬細(xì)胞：5%）。脾臟中B細(xì)胞表達(dá)量最高（圖4D）。

（5）為了證實脾臟中B細(xì)胞表達(dá)量最高，測量了脾臟中的總基因表達(dá)量。aCD20是阻斷B細(xì)胞的抗體。B細(xì)胞損耗脾臟基因表達(dá)減少（圖4E）。

圖4.DODAP/DOPE-LNP主要分布在抗原呈遞細(xì)胞中

 

6.補體受體的攝取途徑可能是脾臟活性高的關(guān)鍵因素

        作者研究導(dǎo)致脾臟活性高的因素：據(jù)報道，與基于磷脂酰膽堿 (PC) 的脂質(zhì)（例如 DOPC）相比，用基于磷脂酰乙醇胺 (PE) 的脂質(zhì)（例如 DOPE 和 POPE）制備的脂質(zhì)膜與補體3 (C3) 的結(jié)合更有效 。APC上表達(dá)的補體受體 (CR)。特異性抗體阻斷 CD21/35 (CR1/2) 受體，在B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)，是脾臟中吸收DODAP-LNP的主要細(xì)胞（圖4）。ICR小鼠在注射DODAP-LNP之前用抗CD21/35抗體處理以阻斷CR。檢測脾細(xì)胞的基因表達(dá)和LNP攝取。抗體介導(dǎo)的 CD21/35 阻斷顯著降低了脾臟中的基因表達(dá)和脾細(xì)胞的攝取，如圖 5 所示。CR使脾臟的活性增高。脾細(xì)胞LNP攝取的減少可能是CR被阻斷時導(dǎo)致活性降低，然而，這并不能解釋轉(zhuǎn)染活性的巨大差異，表明抗體處理不僅抑制了攝取，還抑制了一些細(xì)胞內(nèi)過程。

圖5.CD21/35受體的攝取影響脾臟中基因表達(dá)和積累

 

7.DODAP-LNPs-pDNA抑制腫瘤生長

         作者檢測了DODAP-LNP的DNA疫苗預(yù)防性和治療性抗腫瘤的效果。靶向脾載體DODAP-DOPE- pOVA、DODAP-DOPE-pLuc，對照PBS、pOVA、非靶向脾載體DODAP-DOPC-pOVA。預(yù)防性研究方面，小鼠接種腫瘤細(xì)胞前1周，注射LNP觀察腫瘤體積。治療性研究方面，小鼠接種腫瘤細(xì)胞后在第7天、10天和14天注射不同的LNP（圖6）。結(jié)果顯示：預(yù)防性方面，pOVA和DODAP-DOPC-pOVA都有抑制腫瘤生長的作用，DODAP-DOPE-pLuc和PBS組結(jié)果相當(dāng)，與對照組PBS結(jié)果相比DODAP-DOPC-pOVA腫瘤抑制效果最佳（圖6A）。治療性方面，DODAP-DOPE-pOVA 顯示腫瘤生長較慢，而其他對照與PBS治療組相當(dāng)（圖 6B）。DODAP-DOPE-LNP是一種有效的靶向脾載體，其在APC中表達(dá)抗原并誘靶向腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。

圖6.包封抗原(OVA)編碼pDNA的不同DODAP-LNP預(yù)防和治療抗腫瘤作用

8.免疫反應(yīng)分析

         檢測了DODAP-LNP治療后的免疫反應(yīng)，結(jié)果表明：注射后2h和6h血清結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6、IFN-α、β、IFN-γ的LNP-pLuc和LNP-pOVA可誘導(dǎo)更高的血清細(xì)胞因子產(chǎn)生，pDNA或PBS為對照（圖7A）。IL-6、IFN-γ和IFN-α做了抗原特異性細(xì)胞毒作用和抗原特異性抗體產(chǎn)生實驗。結(jié)果表明:含有非特異性CPG的pLuc質(zhì)粒比不含CPG的pOVA質(zhì)粒產(chǎn)生更高的細(xì)胞因子。

LNP-pOVA產(chǎn)生強OVA特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）活性和強OVA特異性IgG抗體滴度（圖7B，C）。驗證了B細(xì)胞參與抗腫瘤免疫反應(yīng)，在存在或不存在特異性抗體的情況下測量OVA特異性CTL活性和OVA特異性IgG抗體滴度(aCD20)，aCD20會消耗B細(xì)胞。aCD20抗體的顯著降低CTL活性和抗體產(chǎn)生（圖7D，E），表明B淋巴細(xì)胞是負(fù)責(zé)免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞，無論是先天性免疫還是適應(yīng)性免疫。結(jié)果表明，脾臟中的B細(xì)胞是腫瘤特異性免疫刺激的重要靶標(biāo)。

圖7.免疫反應(yīng)分析

          綜上所述，作者報告了一種新型脂質(zhì)組合，可實現(xiàn)pDNA有效的靶向脾臟的基因遞送。這種脂質(zhì)組合主要由DODAP和常見的輔助脂質(zhì)組成；DODAP/DOPE-LNPs靶向脾臟基因表達(dá)效果顯著，目前是遞送基因的最佳組合。包封編碼pDNA的LNP抗原有預(yù)防性和治療性抗腫瘤作用。基恩科致力于研發(fā)LNP遞送pDNA的產(chǎn)品，將會提供LNP遞送pDNA的技術(shù)服務(wù)及現(xiàn)貨產(chǎn)品，敬請期待！