嵌合抗原受體（CAR）修飾的T細胞在治療癌癥方面效果顯著，但制造過程復雜。受體靶向慢病毒載體（LV）選擇性地將基因遞送到T細胞亞型可能促進和改善CAR-T細胞的產(chǎn)生，但到目前為止，傳統(tǒng)LV（水泡性口炎病毒VSV-LV）的基因遞送率低。為了改善遞送效率低的問題，該文章用轉(zhuǎn)導增強劑Vectofusin-1顯著增強CD4和CD8 LV的基因遞送，而不會損失靶細胞選擇性和所產(chǎn)生的CAR T細胞的殺傷能力。
轉(zhuǎn)導增強劑通過促進載體和細胞的有效共定位來促進載體細胞進入。轉(zhuǎn)導增強劑可以是陽離子聚合物、脂質(zhì)或肽（如聚布倫、硫酸魚精蛋白），甚至是小分子。Vectofusin-1，一種富含組氨酸的陽離子兩親性短肽，可促進人CD34造血干細胞與各種假型LV的轉(zhuǎn)導。對于人T和B細胞，使用Vectofusin-1增強了用長臂猿白血病病毒（GALV）包膜蛋白轉(zhuǎn)導，作者研究了Vectofusin-1對CD4-LV和CD8-LV以及VSV-LV和用BaEV糖蛋白（BaEV-LV）假型的LV轉(zhuǎn)導效率的影響，轉(zhuǎn)導第二代CD19-CAR到人類T細胞。截短的低親和力神經(jīng)生長因子受體（DLNGFR）作為報告基因。
1.Vectofusin-1提高CAR基因CD4和CD8靶向LV的轉(zhuǎn)導率
靶向CD4-LV和CD8-LV載體設(shè)計方案，編碼第二代CD19特異性CAR通過P2A切割位點連接的報告蛋白DLNGFR（圖1A）。作者用CD4+T細胞和CD8+T細胞做了CD4-LV、CD8-LV、VSV-LV、BaEV-LV的轉(zhuǎn)導增強劑Vectofusin-1的對比實驗（圖1B）。用流式檢測，實驗結(jié)果表明（1）Vectofusin-1提高了CD4-LV的轉(zhuǎn)導效率且特異性好。（2）Vectofusin-1提高了CD8-LV的轉(zhuǎn)導效率且特異性好。（3）Vectofusin-1降低VSV-LV的轉(zhuǎn)導效率。（4）BaEV-LV自身轉(zhuǎn)導效率最高，加入Vectofusin-1后其效率更高（圖1B）。為了研究觀察到的 Vectofusin-1 效果是否獨立于所使用的供體、PBMC激活條件或特定載體批次，在兩種不同的PBMC刺激方案下，使用不同的供體并使用兩到五個載體進行多次轉(zhuǎn)導（圖1C）。用流式細胞術(shù)檢測，實驗結(jié)果表明Vectofusin-1顯著改善了CD4-LV、CD8-LV和BaEV-LV的轉(zhuǎn)導效率，對VSV-LV有損耗，對載體特異性無影響，BaEV-LV的轉(zhuǎn)導效率最高（圖1C）。
圖1 Vectofusin-1轉(zhuǎn)導增強劑對不同假分型慢病毒載體CAR基因遞送情況
2.Vectofusin-1不影響CAR-T細胞的殺傷能力
作者分析了Vectofusin-1是否影響CAR-T細胞在殺傷CD19陽性腫瘤細胞方面的功能。用CD8-LV轉(zhuǎn)導的CAR-T細胞與羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記的CD19陽性Nalm-6細胞按不同比例孵育，做Vectofusin-1的對比實驗。通過流式細胞術(shù)測定靶細胞裂解。加與不加Vectofusin-1均能夠殺死Nalm-6 腫瘤細胞，并且與未轉(zhuǎn)導的T細胞相比，顯示出顯著更高的殺傷活性。重要的是，使用或不使用Vectofusin-1轉(zhuǎn)導的CAR-T細胞在靶細胞裂解方面沒有觀察到顯著差異。該結(jié)果表明Vectofusin-1對CAR-T細胞的細胞毒性沒有負面影響（圖2）。
圖2在加Vectofusin-1產(chǎn)生的CAR-T細胞具有功能
3.DLNGFR在LV顆粒表面并作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞中
存在與不存在Vectofusin-1，在受體陽性和陰性細胞上都檢測到DLNGFR的信號（圖3A）。CD4-LV、CD8-LV、VSV-LV使用轉(zhuǎn)導增強劑Vectofusin-1轉(zhuǎn)導CD4+T細胞和CD8+T細胞，檢測DLNGFR信號。Vectofusin-1使CD4-LV的非靶細胞的DLNGFR信號顯著增加，而靶細胞本身DLNGFR信號可達77%。CD8-LV也觀察到了類似的結(jié)果。對于VSV-LV，Vectofusin-1使CD4或CD8非靶細胞DLNGFR信號達到所有LV假分型靶細胞的水平。而靶細胞本身的DLNGFR信號很高（圖3A）。
DLNGFR陽性細胞的百分比在每個時間點都相似，Vectofosin-1使其總體百分比較高，檢測到的DLNGFR陽性T細胞信號強，并隨時間略有升高，與CD4和CD8靶細胞的結(jié)合效率是相當。沒有Vectofosin-1的情況下，同樣能觀察到以上結(jié)果，只是效果不好，并且只與靶細胞結(jié)合（圖3B）。
圖3 Vectofusin-1介導DLNGFR蛋白轉(zhuǎn)移到非靶細胞
為了確定DLNGFR是否結(jié)合到載體顆粒中，進行了DLNGFR特異性ELISA。為了定量DLNGFR，使用重組DLNGFR蛋白作為標準。在編碼CD19-CAR和DLNGFR作為報告基因的載體顆粒中檢測到DLNGFR分子，在編碼GFP中沒有檢測到。DLNGFR分子總量的計算顯示每個顆粒有169至350個DLNGFR（表1）。
LV顆粒與非靶細胞的結(jié)合是否需要LV假分型的包膜蛋白。為了研究不同包膜成分的作用，用附著蛋白CD4-MV-H和CD8NiV-G，融合蛋白MV-F和NiV-F及LV用轉(zhuǎn)導增強劑Vectofusin-1轉(zhuǎn)導CD4+Tcell和CD8+Tcell，檢測DLNGFR信號。結(jié)果顯示，Vectofusin-1使所有假分型LV的PBMC的顆粒結(jié)合以及DLNGFR檢測都得到了增強，而對CD4或CD8靶細胞沒有任何偏好（圖4），并且與CD4-LV和CD8-LV的結(jié)合率相當（圖3）。不使用Vectofusin-1的情況下，LV、MV-F-LV和NiV-F-LV在細胞結(jié)合中效率非常低，而CD4-H-LV和CD8-G-LV僅限靶細胞結(jié)合效率高（圖4）。結(jié)果表明，Vectofusin-1介導的顆粒與細胞的附著獨立于所用的包膜蛋白。
圖4 DLNGFR在沒有包膜糖蛋白的情況下的轉(zhuǎn)移
文章提供的數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)導增強劑Vectofusin-1有促進基于副粘病毒糖蛋白的受體靶向載體將基因轉(zhuǎn)移到T淋巴細胞中。CD4-LV和CD8-LV的轉(zhuǎn)導水平與VSV-LV的轉(zhuǎn)導水平相當。CD4-LV和CD8-LV的轉(zhuǎn)導對各自的T淋巴細胞具有高度選擇性。這種高選擇性以及遞送的CD19-CAR對靶細胞的殺傷沒有受到Vectofusin-1的損害。與此一致，它對T細胞表型、生存能力和PBMC增殖能力的影響，只是微不足道的。
由于CD4-LV和CD8-LV的顆粒數(shù)與VSV-LV的顆粒數(shù)非常相似，不使用Vectofusin-1，它們的轉(zhuǎn)導效率降低是由于與培養(yǎng)細胞膜的低效接觸。Vectofusin-1以前被證明可以組裝成與病毒顆粒結(jié)合的納米纖維，導致其沉淀，從而增加細胞表面的局部濃度。 Vectofusin1的這種作用可能解釋了為什么在向細胞添加病毒30秒后，使用轉(zhuǎn)導增強劑觀察到大量與細胞結(jié)合的載體顆粒。這種作用與所用的包膜蛋白無關(guān)。
DLNGFR不僅經(jīng)常被用作CAR分子的報告蛋白，而且還被用作其他治療性轉(zhuǎn)基因的細胞跟蹤標記。此外，DLNGFR被用作Vectofusin-1分析載體細胞附著行為的標記，因為它被摻入所有產(chǎn)生的載體的顆粒表面，包括VSV-LV。成為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒中的胞質(zhì)蛋白，如GFP，也是可能的，并負責載體細胞融合后不久的經(jīng)典蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，即所謂的假轉(zhuǎn)導。通過詳細的載體細胞結(jié)合研究和摻入分析，作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導后不久DLNGFR的存在不是由于經(jīng)典蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。在4℃下將PBMC與載體顆粒共孵育30秒后立即檢測到DLNGFR，這表明膜融合介導了DLNGFR從包裝細胞轉(zhuǎn)移到PBMC。相反，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是由細胞結(jié)合的載體顆粒介導的（圖5）。Vectofusin-1增強了這種作用，它延長了載體顆粒與沒有膜融合的細胞相關(guān)的時間，至少在受體陰性細胞上是這樣。
圖5 DLNGFR從包裝細胞轉(zhuǎn)移到靶細胞和非靶細胞的工作模型
目前應用于CAR-T產(chǎn)生過程中的T細胞純化步驟比較局限，而靶向CD8和CD4的LV只遞送目的基因到靶細胞群，未來可能有助于改善CAR-T細胞的產(chǎn)生，可作為一種有前景的治療方法。淋巴細胞基因修飾的其他治療應用也可能受益于靶向淋巴細胞亞群的靶向基因遞送。
基恩科生物通過對慢病毒遞送系統(tǒng)工藝的不斷改進和優(yōu)化，針對難轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)導效率低的靶細胞，推出慢病毒轉(zhuǎn)導增強劑，GC-LVreinfircer，轉(zhuǎn)導效率高于Polybreen，并且細胞毒性低，對細胞增殖無影響，可解決部分靶細胞難轉(zhuǎn)導的問題。
