穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系即穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，即目標(biāo)基因表達(dá)元件（過(guò)表達(dá)元件、干擾shRNA元件）整合在宿主基因的基因組中，隨著細(xì)胞傳代可以穩(wěn)定表達(dá)，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建主要有幾種方案：

一、慢病毒感染細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建：

慢病毒因?yàn)榭梢愿腥敬蠖鄶?shù)的分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，包裝技術(shù)成熟，II代和III代慢病毒包裝系統(tǒng)均能包裝高滴度的慢病毒，是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建的首選系統(tǒng)。但是因?yàn)槁《居邪b容量限制，不適合轉(zhuǎn)錄本區(qū)域比較長(zhǎng)的基因，對(duì)較大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒表達(dá)載體中，是由WPRE元件代替PolyA穩(wěn)定以達(dá)到穩(wěn)定mRNA的作用，對(duì)部分基因的翻譯有一定影響。

二、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建：

轉(zhuǎn)座子（Transposon）也稱(chēng)“跳躍基因”，由美國(guó)科學(xué)家芭拉拉·麥克林托克在研究玉米顆粒顏色時(shí)發(fā)現(xiàn)。是普遍存在于各種生命細(xì)胞內(nèi)的可移動(dòng)的遺傳信息元件，通過(guò)“剪切和粘貼”機(jī)制實(shí)現(xiàn)DNA片段在染色體內(nèi)部/之間高效轉(zhuǎn)移。 工程化的轉(zhuǎn)座子是由兩部分組成，包括位于轉(zhuǎn)座子基因兩側(cè)的順式元件短末端反向重復(fù)序列（ITR）和位于兩個(gè)ITR序列之間的轉(zhuǎn)座酶編碼基因序列。轉(zhuǎn)座子是通過(guò)編碼轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶與ITR序列結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶基因在基因序列之間的轉(zhuǎn)移。將轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)元件分離并構(gòu)建在兩個(gè)獨(dú)立在載體上，原來(lái)轉(zhuǎn)座酶的序列替換成感興趣的基因序列（GOI），而轉(zhuǎn)座酶在另外一個(gè)載體上獨(dú)立表達(dá)，將兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，就能實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主基因組上整合，與其他技術(shù)的不同（慢病毒載體介導(dǎo)的基因組整合），在整合酶存在的情況，目的基因會(huì)一直處于切割—整合的狀態(tài)，即連續(xù)在基因組上跳躍。

轉(zhuǎn)座子穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系主要的優(yōu)勢(shì)是其對(duì)基因大小沒(méi)有嚴(yán)苛的限制，文章報(bào)道最多可以實(shí)現(xiàn)200kb的基因插入，另外，隨著睡美人轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，轉(zhuǎn)座子插入效率提高了100倍以上，整合效率與慢病毒效率相當(dāng)。缺點(diǎn)是因?yàn)檗D(zhuǎn)座子系統(tǒng)為了達(dá)到更好的整合效率，一個(gè)目的基因的拷貝大約需要4個(gè)睡美人轉(zhuǎn)座子SB100x轉(zhuǎn)座酶，所以轉(zhuǎn)座酶和目的基因是單獨(dú)的骨架載體，依賴(lài)于細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，對(duì)于原代細(xì)胞、難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞等有一定限制。隨著SB100X轉(zhuǎn)座酶I212S和C176S兩個(gè)突變位點(diǎn)的改進(jìn)。改變了轉(zhuǎn)座酶的穩(wěn)定性，溶解性，顯著降低了轉(zhuǎn)座酶被純化為具有活性重組蛋白的的技術(shù)難度。通過(guò)引入這兩個(gè)突變，創(chuàng)建了一種新型的轉(zhuǎn)座酶突變體，可以通過(guò)RNP的方式將轉(zhuǎn)座酶和目的基因表達(dá)載體電轉(zhuǎn)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)高效率的整合。但是通過(guò)轉(zhuǎn)座子RNP的方式進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建，對(duì)設(shè)備提出了更高的要求。

三、CRISPR/Cas9 基因敲入穩(wěn)住細(xì)胞系構(gòu)建：

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行目的基因（外源基因，抗性基因和熒光標(biāo)志等）的定點(diǎn)敲入，是通過(guò)提供外源模板（Donor載體）依靠細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制NHEJ（非同源末端連接）和HDR（同源同組）完成的。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的NHEJ對(duì)標(biāo)記基因的插入概率明顯高于HDR修復(fù)機(jī)制。

利用CRISPR/Cas9基因敲入構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過(guò)設(shè)計(jì)人PPP1R12C基因的第一個(gè)內(nèi)含子上（AAVS1位點(diǎn)，人基因組安全港）位點(diǎn)sgRNA和donor載體，利用不同的遞送系統(tǒng)遞送目的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)gRNA位置的基因定點(diǎn)敲入。在該位點(diǎn)中插入外源基因片段具有穩(wěn)定表達(dá)、不影響其他基因轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于慢病毒和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，基因敲入方法是基因定點(diǎn)插入，細(xì)胞基因型一定，不存在隨機(jī)插入的風(fēng)險(xiǎn)。但基因敲入的概率不同細(xì)胞，不同位點(diǎn)差異較大，并且需要挑取單克隆以得到基因型一定的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克隆株。隨著基因編輯效率的不斷提高，利用AAVS1位點(diǎn)基因敲入構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系會(huì)越來(lái)越省時(shí)省力。

四、CRISPR SAM系統(tǒng)，通過(guò)融合VP64、MS2-P65-HSF1系統(tǒng)進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建：

CRISPR SAM通過(guò)dCas9-VP64融合蛋白、MS2-P65-HSF1結(jié)合激活蛋白三個(gè)原件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多數(shù)細(xì)胞內(nèi)源基因的特異性激活。CRISPR SAM主要優(yōu)勢(shì)是不受基因大小限制，但需要三種不同抗性病毒逐次或同時(shí)感染目的細(xì)胞，

表1 CRISPR SAM常用載體元件

  CRISPR SAM主要將sgRNA序列構(gòu)建在lenti sgRNA(MS2)_zeo載體中，配合另外兩種慢病毒即可實(shí)現(xiàn)任何一個(gè)基因的特異性激活，為基因功能研究尤其表觀遺傳文庫(kù)篩選提供了更廣闊的應(yīng)用前景。主要缺點(diǎn)是需要三種不同抗性的病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，部分細(xì)胞經(jīng)三種抗性篩選后表型變化明顯。

 根據(jù)不同的基因，不同的細(xì)胞選擇不同的構(gòu)建方法是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建的第一步，也是最重要一步，根據(jù)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)和理論判斷，總結(jié)如下規(guī)律，可做參考：