腺相關(guān)病毒（AAV）載體是治療性基因組編輯的重要遞送平臺(tái)，但受到包裝容量的嚴(yán)重限制。同時(shí)遞送多種載體會(huì)限制劑量和療效，并增加安全風(fēng)險(xiǎn)。本文描述了單載體4.8kb的AAV平臺(tái)表達(dá)Nme2 Cas9的兩種用于片段缺失的sgRNA，或具有同源性定向修復(fù)（HDR）模板的單個(gè)sgRNA。本文還使用CRISPR蛋白來(lái)生產(chǎn)通過(guò)Nme2 Cas9切割自我失活的載體，進(jìn)一步介紹了一種基于納米孔的測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)旨在分析rAAV基因組，并作為載體同質(zhì)性的質(zhì)量控制措施。證明，通過(guò)基于HDR的疾病等位基因校正，可以有效治療小鼠的兩種疾病模型【型遺傳性酪氨酸血癥（HT-I）和I型粘多糖病（MPS-I）】。這些結(jié)果將使單載體AAV的工程化成為可能，從而實(shí)現(xiàn)不同的治療基因組編輯結(jié)果。

一、具有同源性定向修復(fù)（HDR）模板的單個(gè)sgRNA在單載體4.8kb的AAV平臺(tái)表達(dá)Nme2 Cas9。

細(xì)菌和古菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)被稱(chēng)為聚集的、規(guī)則間隔的、短的回文重復(fù)序列（CRISPR），以及它們的CRISPR相關(guān)蛋白，一直處于RNA引導(dǎo)的基因組工程革命的中心，包括基因組編輯。最廣泛采用的CRISPR-Cas基因組編輯平臺(tái)是Cas9核酸內(nèi)切酶，它在與設(shè)計(jì)的單引導(dǎo)RNA（sgRNA）互補(bǔ)的靶DNA序列中產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSBs）。除了sgRNA外，Cas9還需要原間隔區(qū)相鄰基序（PAM）的存在，這是一種接近sgRNA互補(bǔ)靶序列的特異性序列。一旦被切割，細(xì)胞依靠DNA修復(fù)機(jī)制通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）、微同源介導(dǎo)末端連接（MMEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）來(lái)解決這些DSB，后者可以實(shí)現(xiàn)廣泛的精確確定的修復(fù)結(jié)果。最廣泛使用的Cas9同源物是化膿性鏈球菌Cas9[SpyCas9，1368個(gè)氨基酸（aa）]，它表現(xiàn)出強(qiáng)大的編輯效率，并且由于其短的5′-NGG-3′PAM而具有廣泛的靶向范圍。SpyCas9工程改變或減少PAM需求。

單一的AAV系統(tǒng)，其中SauCas9、兩個(gè)sgRNA和一個(gè)HDR供體被設(shè)計(jì)成單個(gè)>5kb的載體構(gòu)建體。然而，這項(xiàng)研究使用了一種缺乏VP2亞基的AAV8衣殼，隨著包裝容量的增加，產(chǎn)生了低的載體滴度。因此，仍然需要使用可以在臨床前和臨床規(guī)模上生產(chǎn)的成熟衣殼與單載體AAV兼容的精確基因組編輯策略。AAV等病毒載體，它作為遞送方式具有很大的潛力，但包裝容量嚴(yán)重受限（在大多數(shù)情況下<5kb）。在Nme2Cas9（5′-NNNCC-3′PAM）的更小的Cas9、高細(xì)胞編輯精度和靶向靈活性的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一體式AAV-Nme2Cas9載體系統(tǒng)，其實(shí)用性超過(guò)了初始版本，該版本僅編碼效應(yīng)子和一種sgRNA。最小化Nme2 Cas9表達(dá)盒：其調(diào)節(jié)元件和sgRNA提供了額外的編碼能力，可用于整合第二種sgRNA。驗(yàn)證了雙sgRNA系統(tǒng)的特定排列和方向，以確定其被包裝到單個(gè)AAV載體中的能力。

二、4種縮短的Nme2 Cas9+dual-sgRNA載體

為了設(shè)計(jì)具有額外功能的單個(gè)Nme2 Cas9載體，創(chuàng)建了一個(gè)縮短的Nme2 Cas9+sgRNA主鏈。Nme2 Cas9結(jié)構(gòu)信息和指導(dǎo)要求的經(jīng)驗(yàn)測(cè)試指導(dǎo)下，截?cái)嗔酥貜?fù)鏈，以產(chǎn)生兩個(gè)縮短的121nt和100nt sgRNA（分別為Nme.sgRNA-121和Nme.sgRNA-100）。將截短的引物克隆到先前發(fā)表的Nme2 Cas9-AAV主鏈中。通過(guò)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293T（人類(lèi)）和Neuro2a（小鼠）細(xì)胞中，對(duì)CYBB、LOC 100505797和Fah基因組的編輯效率進(jìn)行比較，結(jié)果表明Nme.sgRNA-100部分損害Nme2 Cas9活性，而Nme.sgRNA-121的性能與全長(zhǎng)Nme.sgRNA的性能更一致。在同一主鏈中包含兩個(gè)sgRNA可能會(huì)誘導(dǎo)截短的載體基因組的形成而對(duì)這種設(shè)計(jì)造成重大障礙。因此設(shè)計(jì)了攜帶兩個(gè)不同位置和方向的sgRNA-121盒的AAV:Nme2 Cas9構(gòu)建體。將這四個(gè)主鏈中的每一個(gè)包裝到AAV8衣殼中，并分離病毒DNA。

兩種設(shè)計(jì)主要包含全長(zhǎng)、非截短的~4.8Kb基因組

基于納米孔的實(shí)時(shí)測(cè)序平臺(tái)，測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，與主要包含從ITR到ITR的全長(zhǎng)基因組的雙sgRNA:Design 4載體不同，雙sgRNA:Design 1產(chǎn)生了高頻率的截短基因組。這些截?cái)嘀饕性趦蓚€(gè)位置，第一個(gè)定位在sgRNA表達(dá)盒上，產(chǎn)生只攜帶單個(gè)sgRNA的載體；第二個(gè)位于h Nme2 Cas9轉(zhuǎn)基因的3′端。

為了測(cè)試這些構(gòu)建體誘導(dǎo)節(jié)段缺失的功效，設(shè)計(jì)1和設(shè)計(jì)4切除跨越Hpd基因外顯子3和4的606bp片段的能力。

分析表明，只有當(dāng)間隔物gRNA-I和gRNA-II共表達(dá)時(shí)，這兩種質(zhì)粒才能有效地產(chǎn)生預(yù)期的節(jié)段缺失。

二、注射小鼠，驗(yàn)證AAV效果。

編碼肝酶富馬酸乙酰乙酸水解酶（Fah）的Fah基因通過(guò)在外顯子5（Fahneo/neo）中插入新霉素表達(dá)盒而被破壞。這種疾病在小鼠中的一個(gè)標(biāo)志是，當(dāng)小鼠不在補(bǔ)充有藥物2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲?；?1,3-環(huán)己烷二酮（NTBC）的水中維持時(shí)，體重會(huì)逐漸減輕，NTBC阻斷FAH上游的酪氨酸分解代謝途徑，防止因FAH損失而導(dǎo)致的肝毒性代謝產(chǎn)物的積累。在NTBC退出前對(duì)每組中的一只小鼠以及C57BL/6小鼠進(jìn)行了編輯評(píng)估，在NTBC退出后，F(xiàn)ahneo/neo小鼠被有效地從HT-I的致死表型中拯救出來(lái)，3周體重穩(wěn)定；相反，注射PBS的Fahneo/neo小鼠在NTBC停藥后4-13天內(nèi)體重減輕了10%以上，并被安樂(lè)死。在NTBC退出前對(duì)每組中的一只小鼠以及C57BL/6小鼠進(jìn)行了編輯評(píng)估，在NTBC退出后，F(xiàn)ahneo/neo小鼠被有效地從HT-I的致死表型中拯救出來(lái)，3周體重穩(wěn)定；相反，注射PBS的Fahneo/neo小鼠在NTBC停藥后4-13天內(nèi)體重減輕了10%以上，并被安樂(lè)死。

兩種雙sgRNA載體設(shè)計(jì)的Nme2 Cas9在體內(nèi)成功誘導(dǎo)了節(jié)段缺失。

在C57BL/6小鼠中，為了不表現(xiàn)出編輯細(xì)胞的選擇性增殖，用雙sgRNA處理：設(shè)計(jì)1或4在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間分別產(chǎn)生50.5±8.7%和33.6±6%的節(jié)段缺失；在NTBC退出前分析的小鼠表現(xiàn)出33.3%（設(shè)計(jì)1）和15.8%（設(shè)計(jì)4）的節(jié)段缺失效率。NTBC停藥和選擇性肝細(xì)胞擴(kuò)增三周后，載體設(shè)計(jì)1和4分別產(chǎn)生35.7±3.3%和33.2±4%的節(jié)段缺失。

除了片段缺失外，在兩個(gè)靶位點(diǎn)觀察到顯著頻率的小indel。

在C57BL/6小鼠中，以2.8±0.7%（設(shè)計(jì)1）和2.4±0.8%（設(shè)計(jì)4）的頻率檢測(cè)到DSB位點(diǎn)的載體片段整合，在NTBC退出前以2.3%（設(shè)計(jì)1）和1.5%（設(shè)計(jì)4），NTBC退出后以3.5±0.5%（設(shè)計(jì)1）和2.7±0.5%（設(shè)計(jì)4）檢測(cè)到載體片段整合。

與SMRT測(cè)序相比，UDiTaS顯示片段缺失的頻率較低，但反轉(zhuǎn)和載體整合的頻率較高。