慢病毒載體能夠在分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞（包括有絲分裂后神經(jīng)元）中高效、持久和穩(wěn)定地表達(dá)轉(zhuǎn)基因。因此，它們有望成為治療性基因轉(zhuǎn)移載體。 

 轉(zhuǎn)基因的有效和持續(xù)表達(dá)是通過(guò)將前病毒基因組插入宿主細(xì)胞染色體來(lái)介導(dǎo)的。然而，前病毒的隨機(jī)插入(稱(chēng)為“插入突變”)，可能會(huì)破壞關(guān)鍵基因，如抑癌基因和蛋白激酶/磷酸酶的基因，這可能會(huì)導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)化或細(xì)胞死亡。 

病毒前體插入宿主細(xì)胞染色體是由病毒整合酶介導(dǎo)的。為了避免插入突變，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了整合有效的慢病毒載體（IDLV），其中突變被引入整合酶基因的編碼序列或病毒基因組中整合酶連接和介導(dǎo)插入的位點(diǎn)（att位點(diǎn)）。來(lái)自IDLV的非整合前病毒以附加體形式存在于細(xì)胞核中，并在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因至少幾個(gè)月。因此，IDLV是未來(lái)臨床應(yīng)用中更安全、更有前景的基因治療載體。

盡管如此，IDLV中仍有幾個(gè)問(wèn)題有待研究清楚，包括與野生型慢病毒載體（WTLV）相比，IDLV表達(dá)的轉(zhuǎn)基因數(shù)量；轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)多久，以及IDLVs用于基因治療的治療效果是否與WTLVs相當(dāng)。

本研究探索了IDLVs轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平相對(duì)于WTLVs長(zhǎng)達(dá)1年的時(shí)間變化。此外，通過(guò)檢測(cè)脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型模型小鼠（SCA3小鼠）在注射表達(dá)治療蛋白CRAG（collapsin response mediator protein associated molecular associated guanosine triphosphatase）的IDLVs或WTLVs后的行為恢復(fù)，來(lái)評(píng)估IDLVs作為基因治療載體的有用性。 

一、將突變整合酶基因亞克隆到慢病毒包裝質(zhì)粒pCAGkGP1R中

在小鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)啟動(dòng)子的控制下，我們使用I類(lèi)整合酶突變產(chǎn)生表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)或GFP-P2A-CRAG的IDLV(圖1a和b)。該突變對(duì)逆轉(zhuǎn)錄、整合前復(fù)合體的核導(dǎo)入或病毒基因組在細(xì)胞核中的環(huán)化沒(méi)有影響。研究中使用的突變包括將第64個(gè)天冬氨酸替換為纈氨酸(D64V)，纈氨酸位于整合酶的核心結(jié)構(gòu)域(圖1a)。 

將突變整合酶基因亞克隆到慢病毒包裝質(zhì)粒pCAGkGP1R中，用于生產(chǎn)IDLV。 

顯示整合酶的三個(gè)結(jié)構(gòu)域和突變（D64V）在整合酶中的相對(duì)位置的示意圖。

（b） 本研究中使用了人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒載體。GFP或GFP-P2A-CRAG的轉(zhuǎn)錄由MSCV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。GFP-P2A-CRAG的mRNA在P2A序列上被處理。因此，CRAG在受感染的細(xì)胞中與GFP分開(kāi)表達(dá)。長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）中的U3區(qū)域是自失活的（ΔU3-LTR）。ψ是封裝信號(hào)，RRE是Rev響應(yīng)元件。

（c和d）通過(guò)定量PCR（c）和蛋白質(zhì)印跡（d）評(píng)估IDLVs和WTLVs的量。

使用相同的方案生產(chǎn)IDLV和WTLV（各四批）。基因組滴度通過(guò)定量PCR測(cè)量，而分別從四種獨(dú)立培養(yǎng)物中獲得的IDLV和WTLV顆粒的量通過(guò)使用針對(duì)包膜糖蛋白VSV-G的抗體的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（ns）。 

二、證明整合酶突變對(duì)HEK293T細(xì)胞中IDLVs的產(chǎn)生沒(méi)有影響

為了檢查整合酶基因的突變是否影響病毒載體的產(chǎn)生，使用相同的方案同時(shí)產(chǎn)生IDLV和WTLV。使用IDLV和WTLV各四批，通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR測(cè)定基因組滴度。WTLV和IDLV的基因組滴度分別為1.42±0.18×1011和1.47±0.29×1011載體基因組（vg）ml?1，兩組之間沒(méi)有顯著差異（圖1c）。我們還評(píng)估了IDLV和WTLV的病毒粒子數(shù)量，這兩種病毒粒子都是通過(guò)使用針對(duì)包膜糖蛋白、水皰性口腔炎病毒G蛋白（VSV-G）的抗體的蛋白質(zhì)印跡從四種獨(dú)立培養(yǎng)物中獲得的。印跡上VSV-G的條帶強(qiáng)度在WTLV和IDLV之間是可比較的（圖1d）。這些結(jié)果表明，整合酶突變不影響人胚胎腎293T（HEK293T）細(xì)胞中慢病毒載體顆粒的產(chǎn)生。 

三、體內(nèi)檢查源自IDLVs和WTLVs的原病毒基因組在HeLa細(xì)胞或小鼠小腦細(xì)胞染色體中的整合。

1. IDLVs和WTLVs感染HeLa細(xì)胞

在6厘米培養(yǎng)皿中用1μl WTLVs和相同體積的具有相同滴度的IDLVs感染培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，感染4天后收集細(xì)胞，并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量Alu-PCR。與WTLV相比，IDLV的整合效率顯著降低至1/3850；IDLVs與WTLVs的原病毒整合率為2.6±0.6×10?4（Po0.01，n=8對(duì)培養(yǎng)物）（圖1e）。 

（e和f）在體內(nèi)培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞（e）或小鼠小腦（f）中，與WTLVs相比，IDLVs的整合顯著減少。 

2. IDLVs和WTLVs注射小鼠。

將10μl在MSCV啟動(dòng)子控制下表達(dá)GFP的IDLV（1.47×1011 vg ml?1）和相同體積的WTLV（1.42×1011 vg ml?1)注射小鼠，注射后1周，在熒光立體顯微鏡下切除表達(dá)GFP的小腦組織。隨后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量B1-PCR對(duì)整合的前病毒基因組進(jìn)行定量。IDLVs在小腦中的體內(nèi)整合效率顯著降低至WTLVs的1/100（Po0.001）（圖1f）。 

 因此，整合酶中的D64V突變可以明顯阻止IDLV在體內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞和小腦中的原病毒整合到宿主細(xì)胞基因組中。 

四、注射病毒1年后IDLVs和WTLVs在小腦中GFP表達(dá)的時(shí)空分布。

研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)IDLVs在小腦內(nèi)的原整合效率是WTLVs的1/100。

將10 μl的IDLVs (1.47 × 1011 vg ml - 1)和相同體積的WTLVs (2.69 × 1011 vg ml - 1)注射到小鼠小腦中。小鼠在注射病毒后的2、6和12個(gè)月被殺死。在病毒注射后2個(gè)月和6個(gè)月熒光立體顯微鏡下檢測(cè)到，IDLVs和WTLVs的整個(gè)小腦發(fā)出的GFP熒光大體相同(圖a、b、g和h)。在病毒注射后1年，IDLVs處理的小腦上的GFP熒光區(qū)域(圖i)明顯減少，而wtlv處理的小腦上的熒光區(qū)域沒(méi)有減少(圖c)。

圖2:注射WTLVs或IDLVs的小腦中轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的時(shí)間變化。（a–l）整個(gè)大腦、（a–c和g–I）小腦蠕蟲(chóng)矢狀切面、（d–f和j–l）代表性GFP熒光圖像。小鼠接受了表達(dá)GFP（a–f）的WTLV和表達(dá)GFP的IDLV（g–l）的注射。分別在注射后2個(gè)月（上圖）、6個(gè)月（中圖）和12個(gè)月（下圖）檢測(cè)小腦中GFP的表達(dá)。 

接受WTLVs或IDLVs注射的小腦蠕蟲(chóng)的矢狀切面顯示GFP主要在浦肯野細(xì)胞（PC）中表達(dá)，而在分子中的中間神經(jīng)元中表達(dá)效率較低層（圖2d、f和j–l）。由于小腦皮層的GFP熒光圖像是從靠近病毒注射部位的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域獲得的，因此即使在注射IDLVs 12個(gè)月后，PC中的GFP表達(dá)似乎也能維持（圖2l）。

在用IDLVs或WTLVs處理的小腦中定量檢測(cè)PC胞體中的GFP熒光強(qiáng)度，并且由IDLVs產(chǎn)生的GFP的熒光水平表示為相對(duì)于由WTLVs引起的熒光水平的比率。注射后2個(gè)月，IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的PC中的GFP熒光強(qiáng)度約為WTLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中觀(guān)察到的熒光強(qiáng)度的93%，并且在IDLV和WTLV處理的小鼠之間，PC胞體中的GFP-熒光強(qiáng)度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。然而，在注射后6個(gè)月和12個(gè)月，GFP熒光強(qiáng)度分別顯著降低到WTLV熒光強(qiáng)度的87%（Po0.05）和49%（Po0.001）（圖2m）。

五、用表達(dá)CRAG的IDLVs處理SCA3小鼠，旋轉(zhuǎn)棒性能的恢復(fù) 

將表達(dá)CRAG的WTLV注射到共濟(jì)失調(diào)SCA3小鼠的小腦皮層，該小鼠在PC特異性L(fǎng)7啟動(dòng)子的控制下表達(dá)突變型共濟(jì)失調(diào)SCA3。CRAG的表達(dá)通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑導(dǎo)致PC中突變型共濟(jì)共濟(jì)失調(diào)SCA3聚集體的降解，從而治療共濟(jì)失調(diào)表型。

使用該系統(tǒng)，檢查了注射后長(zhǎng)達(dá)1年的IDLV治療效果。 

將10微升WTLV（超過(guò)1.0×1010轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml?1，大致相當(dāng)于1.0×1011 vg ml?1或更高）和具有相似基因組滴度的IDLV（均表達(dá)GFP-P2A-CRAG）注射到3周齡的SCA3小鼠中，并在病毒注射前和注射后2、6和12個(gè)月檢查旋轉(zhuǎn)棒的性能。 

在加速方案中（圖3a），未經(jīng)治療的SCA3小鼠僅在棒上停留約20秒，在1歲時(shí)，時(shí)間逐漸減少到約10秒。在病毒注射后12個(gè)月內(nèi)，接受單獨(dú)表達(dá)GFP的IDLV注射的SCA3小鼠顯示出與未注射SCA3小鼠大致相同的旋轉(zhuǎn)棒性能。相反，與未注射的對(duì)照SCA3相比，在病毒注射后2個(gè)月（Po0.05）和6個(gè)月（Po0.01）接受表達(dá)GFP-P2A-CRAG的IDLV注射的SCA3小鼠中觀(guān)察到明顯更好的旋轉(zhuǎn)棒性能老鼠。注射后12個(gè)月，性能變差，但仍明顯優(yōu)于未注射的對(duì)照SCA3小鼠（Po0.05）。從WTLV表達(dá)GFP-P2A-CRAG的SCA3小鼠顯示出與從IDLV表達(dá)GFP-P2A-RAG的小鼠相似的時(shí)間過(guò)程。然而，在注射后12個(gè)月，它們的表現(xiàn)與未注射SCA3小鼠的表現(xiàn)無(wú)法區(qū)分。

類(lèi)似地，在恒速方案中（圖3b），與未注射SCA3小鼠相比，在病毒注射后2個(gè)月（Po0.001）、6個(gè)月（Po0.01）和12個(gè)月（Po0.05），注射表達(dá)GFP-P2ACARG的IDLV，而不是單獨(dú)注射GFP，顯著提高了旋轉(zhuǎn)棒的性能。通過(guò)WTLV表達(dá)GFP-P2A-CRAG的SCA3小鼠在注射后2個(gè)月（Po0.01）和6個(gè)月（Po0.05）也顯示出比未注射的SCA3鼠更好的性能；然而，與加速模式類(lèi)似，在注射后12個(gè)月，它們的表現(xiàn)與未注射SCA3小鼠的表現(xiàn)無(wú)法區(qū)分。 

圖3。通過(guò)小腦注射表達(dá)CRAG的IDLV在注射后12個(gè)月內(nèi)改善SCA3小鼠的運(yùn)動(dòng)行為。（a和b）用旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。在病毒注射前和注射后2、6和12個(gè)月，小鼠每天接受8次加速（0–40 r.p.m.）（a）旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)，隨后接受恒定（5 r.p.m.s）（b）旋轉(zhuǎn)棒（各4次試驗(yàn)）。將未注射的SCA3小鼠（未注射，n=7只小鼠）的轉(zhuǎn)子棒性能與注射表達(dá)GFP-P2A-CRAG的WTLVs（+WTLV-CRAG，n=5）、表達(dá)GFP-P22A-CRAG（+IDLV-CRAG，n=5個(gè)）或單獨(dú)表達(dá)GFP的IDLVs（+IDLV-GFP，n=5次）的SCA3鼠的轉(zhuǎn)子棒表現(xiàn)進(jìn)行比較。與未注射的SCA3小鼠相比，注射表達(dá)GFP-P2A-CRAG的IDLVs（而不是單獨(dú)注射表達(dá)GFP的IDLVs）的SCA3鼠在注射后12個(gè)月內(nèi)顯著改善了其旋轉(zhuǎn)棒性能。用表達(dá)GFP-P2A-CRAG的WTLV處理的SCA3小鼠在注射后2個(gè)月和6個(gè)月時(shí)也改善了它們的性能，但在12個(gè)月時(shí)沒(méi)有改善*Po0.05、**Po0.01、***Po0.001（與未注射SCA3小鼠相比）、?Po0.05和??Po0.01（與單獨(dú)表達(dá)GFP的SCA3小鼠比較），通過(guò)單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Tukey的事后檢驗(yàn)

六、表達(dá)CRAG的IDLV顯著降低突變型ataxin-3聚集體

殺死病毒載體注射的SCA3小鼠和未注射的轉(zhuǎn)基因同窩仔，以檢測(cè)CRAG表達(dá)對(duì)PC中共濟(jì)失調(diào)蛋白-3聚集體的影響。只檢測(cè)了GFP陽(yáng)性區(qū)域，因?yàn)镚FP陰性區(qū)域曾經(jīng)從IDLV中表達(dá)CRAG，并在此后表達(dá)倒退，與未感染區(qū)域無(wú)法區(qū)分。因此，盡管GFP-P2A-CRAG的表達(dá)水平在WTLV組（圖4b）和IDLV處理組（圖4c）之間似乎相似，但如圖2i所示，在IDLV處理的小腦中，GFP表達(dá)區(qū)域確實(shí)受到顯著限制。用突變ataxin-3和calbindin標(biāo)記的HA的免疫組織化學(xué)顯示，在未注射的SCA3小鼠中，沿著被破壞的PC層有許多大的聚集體（圖4a、d、g和j），而在從WTLV（圖4b、e、h和k）或IDLV（圖4c、f、I和l）表達(dá)CRAG的SCA3鼠中，沿著PC層的聚集體的數(shù)量和大小減少。 

圖4。通過(guò)IDLV介導(dǎo)的CRAG表達(dá)顯著減少SCA3小鼠PC中突變型ataxin-3聚集體。（a–l）注射表達(dá)GFP-P2A-CRAG的WTLV（中間面板）或IDLV（右側(cè)面板）的SCA3小鼠的小腦切片和未注射SCA3小鼠（左側(cè)面板）的小腦切片在病毒注射后12個(gè)月產(chǎn)生。對(duì)切片進(jìn)行GFP（a–c）、HA標(biāo)記的突變體ataxin-3（d–f）和鈣結(jié)合蛋白（g–i）的三重免疫染色。合并后的圖像顯示在最低的面板（j–l）中。（m） 未注射SCA3小鼠和注射表達(dá)GFP-P2A-CRAG的WTLVs或IDLVs的小鼠切片中每100μm長(zhǎng)度的PC層的PC數(shù)量。（n） 未注射SCA3小鼠和注射表達(dá)GFP2A-CRAG的WTLVs或IDLVs的小鼠切片中每100μm長(zhǎng)度的PC層中GFP陽(yáng)性PC的數(shù)量。（o） 在未注射SCA3小鼠和注射表達(dá)GFP-P的WTLVs或IDLVs的小鼠的切片中，每100μm長(zhǎng)度的PC層中突變ataxin-3聚集體的數(shù)量。

計(jì)算了來(lái)自未注射SCA3小鼠和通過(guò)WTLVs或IDLVs表達(dá)CRAG的小鼠（每組超過(guò)三只小鼠）的PC層長(zhǎng)度超過(guò)100μm的PC數(shù)量。 

通過(guò)鈣結(jié)合蛋白免疫標(biāo)記顯示，未注射的SCA3小鼠（6.3±0.5個(gè)PC）和用表達(dá)CRAG的WTLVs（7.8±1.1個(gè)PC）或IDLV（7.8±0.7個(gè)PC）處理的小鼠之間，每100μm長(zhǎng)度的PC層的平均PC數(shù)沒(méi)有顯著差異（圖4m）。證實(shí)，在WTLV和IDLV處理的SCA3小鼠之間，檢測(cè)區(qū)域中轉(zhuǎn)導(dǎo)的PC的密度大致相同（圖4n）。 

然后，計(jì)算了沿著100μm以上長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)導(dǎo)PC層的直徑超過(guò)10μm2的聚集體的數(shù)量。與未注射的對(duì)照SCA3小鼠（15.9±1.9個(gè)聚集體）相比，IDLVs（3.9±0.6個(gè)聚集體，Po0.001）和WTLVs（6.6±0.7個(gè)聚集體（Po0.001））的CRAG表達(dá)顯著降低了100μm長(zhǎng)度的PC層中的平均聚集體數(shù)（圖4o）。 

七、結(jié)論

在這項(xiàng)研究中，我們?cè)隗w內(nèi)檢測(cè)了IDLVs在小鼠PC中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間過(guò)程，并使用SCA模型小鼠評(píng)估了與WTLVs相比，IDLVs治療SCA的可用性。注射表達(dá)GFP的IDLV兩個(gè)月后，PC胞體中mRNA的熒光強(qiáng)度和表達(dá)水平與注射WTLV后大致相同。然而，在病毒注射后6個(gè)月和12個(gè)月，IDLV處理的小腦中的GFP熒光和mRNA水平均顯著降低。注射后6個(gè)月和12個(gè)月，IDLV處理的小腦中的GFP mRNA水平分別約為WTLV處理的腦中GFP mRNA的25%和5%。小腦注射表達(dá)CRAG的IDLVs顯著挽救了SCA3小鼠的旋轉(zhuǎn)棒性能，其時(shí)間過(guò)程幾乎與注射WTLVs相同

與WTLVs相比，具有編碼D64V整合酶的突變基因的IDLVs在體內(nèi)將前病毒基因組整合到小腦神經(jīng)元染色體中的能力低約100倍。這一結(jié)果表明，IDLV插入突變的幾率要低得多，如圖3所示。通過(guò)小腦注射表達(dá)CRAG的IDLV在注射后12個(gè)月內(nèi)改善SCA3小鼠的運(yùn)動(dòng)行為。