COVID-19疫苗對(duì)基于Omicron的變體的抗體反應(yīng)較差，需要頻繁加強(qiáng)來維持抗體水平。2023 年 5 月 25 號(hào)，加州理工學(xué)院生物與生物工程系 Pamela J. Bjorkman 教授團(tuán)隊(duì)在 Cell 發(fā)表文章：ESCRT recruitment to SARS-CoV-2 spike induces virus-like particles that improve mRNA vaccines，文章里他們將 mRNA 疫苗與蛋白納米顆粒疫苗相結(jié)合，編碼產(chǎn)生可實(shí)現(xiàn)自我組裝的包膜病毒樣顆粒（eVLPs），克服了這一短處。這個(gè)可實(shí)現(xiàn)自我組裝的包膜病毒樣顆粒（eVLPs）在質(zhì)膜尾部含有EABR成分，以招募ESCRT（endosomal sorting complex required for transport），使新生成的eVLP能夠被細(xì)胞以出芽形式分泌。純化的SARS-CoV-2 Spike EABR eVLPs呈現(xiàn)密集排列，在小鼠中引發(fā)超強(qiáng)的抗體反應(yīng)。應(yīng)用該技術(shù)構(gòu)建的含有EABR的Spike mRNA-LNP疫苗比經(jīng)典的mRNA-LNP能夠誘導(dǎo)更加持久和高效的中和抗體反應(yīng)及CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。在加強(qiáng)接種后3個(gè)月，疫苗誘導(dǎo)的血清對(duì)Omicron的中和抗體水平比經(jīng)典的mRNA-LNP疫苗高10倍以上。因此，EABR技術(shù)是提高疫苗持久性的一個(gè)非常重要的增效技術(shù)。

一、ESCRT通過募集到刺突細(xì)胞質(zhì)尾部從而誘導(dǎo)eVLP組裝

1、Spike-EABR 抗原序列設(shè)計(jì)

將不同來源的EABR融合到S蛋白的截短的細(xì)胞質(zhì)尾部，通過短的GlySer連接子從其C末端分離（圖1A和1B）。S蛋白包含D614G取代、弗林蛋白酶切割位點(diǎn)、S2亞基中的兩個(gè)脯氨酸取代（2P）以穩(wěn)定融合前構(gòu)象，并且C末端21殘基被截短以通過去除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）-滯留信號(hào)（DCT）來優(yōu)化細(xì)胞表面表達(dá)（圖1B）。我們?cè)u(píng)估了來自人CEP55蛋白的EABR片段，該片段在胞質(zhì)分裂過程中結(jié)合TSG101和ALIX（圖1B）。為了進(jìn)行比較，從馬傳染性貧血病毒（EIAV）p9蛋白、埃博拉病毒（EBOV）VP40蛋白的殘基1-44和HIV-1 p6蛋白中獲得了在病毒出芽過程中募集早期ESCRT蛋白的病毒晚期結(jié)構(gòu)域（圖S1A）。假設(shè)，可以通過阻止EABR融合蛋白的內(nèi)吞作用來延長蛋白質(zhì)留在質(zhì)膜與ESCRT蛋白相互作用的持續(xù)時(shí)間，從而增強(qiáng)eVLP的產(chǎn)生。因此，添加了內(nèi)吞作用預(yù)防基序（EPM），這是一種47個(gè)殘基的插入，來源于小鼠Fcγ受體FcgRII-B1胞質(zhì)尾部（圖1A和1B），將FcgRII-B1束縛在細(xì)胞骨架上，以防止包被凹坑定位和內(nèi)吞作用。

2、為什么選擇 CEP55 蛋白的 EABR 片段實(shí)現(xiàn)自組裝？

研究人員用編碼 S-EABR，S-p9，S-VP401-44 以及 S-p6 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Ex-pi293F 細(xì)胞，20%蔗糖緩沖液超速離心，收集上清液，測定上清液中產(chǎn)生 eVLP 的數(shù)量。Western blot分析顯示，在S-EABR構(gòu)建體中檢測到最高的S蛋白水平，這表明CEP55 EABR誘導(dǎo)了含S的evlp的有效自組裝（圖1C和S1B）。S- eabr構(gòu)建體稀釋為1:400時(shí)，與S-p9構(gòu)建體在1:40稀釋時(shí)產(chǎn)生了相似的強(qiáng)烈條帶，表明來自 CEP55 的 EABR 高效觸發(fā) S 蛋白自組裝成 eVLPs，要比 S-p9 蛋白組裝的 eVLPs 高出 10 倍。CEP55 EABR能結(jié)合ALIX和TSG101 17，而EIAV p9只結(jié)合ALIX,23這表明有效的eVLP組裝需要兩種ESCRT蛋白的最佳募集。S-p6和S- vp401 - 44樣品含有很少或沒有S蛋白，這表明eVLP的組裝效率低，可能是由于對(duì)ESCRT蛋白的親和力較低（圖1C和S1B）。

3、EABR序列優(yōu)化處理

通過實(shí)驗(yàn)不同的EABR序列進(jìn)一步證明了S-EABR構(gòu)建體（圖1B），發(fā)現(xiàn)添加第二個(gè)EABR結(jié)構(gòu)域（S-2xEABR）減少了eVLP的產(chǎn)生（圖1D）。為了研究S-EABR-eVLP組裝是否依賴于ESCRT募集，研究人員取代與ALIX相互作用所必需的EABR殘基（CEP55中的Tyr187）來產(chǎn)生S-EABRmut（圖S1A）。純化的S-EABR-eVLP樣品在1:200稀釋時(shí)產(chǎn)生了一個(gè)強(qiáng)帶，而S-EABRmut在1:20稀釋時(shí)卻沒有檢測到條帶，這表明S-EABRmut不再產(chǎn)生eVLP，募集到 ALIX 對(duì)于 eVLP 組裝來說至關(guān)重要（圖1D）。為了確定eVLP組裝所需的最小EABR序列，研究人員設(shè)計(jì)了融合到完整EABR結(jié)構(gòu)域（CEP55170–213）、EABRmin1（CEP55180–213）和EABRmin2（CEP55180-204）的S構(gòu)建體（圖S1A）。雖然EABRmin2的S-EABR eVLP產(chǎn)率降低，但EABRmin1的生產(chǎn)效率保持不變（圖1E）。

4、評(píng)估EPM在S-EABR構(gòu)建體的細(xì)胞質(zhì)尾部內(nèi)的作用

研究人員測試了無EPM的S-EABR構(gòu)造體的eVLP產(chǎn)生。Western blot分析顯示表明，與無EPM的S-EABR相比，S-EABR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測到eVLP純化后S蛋白的量明顯多，而去除掉 EPM 序列，eVLP 產(chǎn)生量顯著減少。表明EPM增強(qiáng)了eVLP的產(chǎn)生（圖1F）。

5、比較其他 eVLP 生產(chǎn)方法

研究人員還將S-EABR構(gòu)建體與其他需要S蛋白與結(jié)構(gòu)病毒蛋白共表達(dá)的eVLP方法進(jìn)行了比較，如HIV-1 Gag或SARS-CoV-2 M、N和E蛋白。Western blot分析顯示，純化的S-EABR eVLP級(jí)分含有的S蛋白比通過S和Gag或S、M、N和E的共表達(dá)產(chǎn)生的eVLP多至少10倍（圖1G），這表明S-EABR eVLP比其他eVLP方法更有效地組裝和/或結(jié)合S蛋白。純化的S- eabr eVLPs與從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中純化的S-鐵蛋白納米顆粒相比，含有更高水平的S蛋白，在動(dòng)物模型中已被證明能引起有效的免疫反應(yīng)。

二、S-EABR eVLPs誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生強(qiáng)效抗體反應(yīng)

在C57BL/6小鼠中評(píng)估了純化的S-EABR eVLP作為針對(duì)SARS-CoV-2的候選疫苗的潛力（圖2A）。通過在20%蔗糖緩沖液上超速離心，然后進(jìn)行尺寸排阻色譜（SEC），從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液中純化S-EABR eVLP，并通過定量Western blot分析測定S蛋白濃度（圖S2A和S2B）。將S-EABR eVLP的免疫與純化的可溶性S和共價(jià)連接到SpyCatcher-mi3蛋白質(zhì)納米顆粒（S-mi3）上的可溶性S進(jìn)行比較。在Sigma佐劑存在的情況下，在第0天和第28天通過皮下注射對(duì)所有免疫原給予0.1 ug劑量（基于S蛋白含量計(jì)算）（圖2A），研究人員通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和體外假病毒中和試驗(yàn)評(píng)估血清抗體反應(yīng)。

S-EABR eVLP在所有小鼠中引發(fā)了針對(duì)SARS-CoV-2（WA1變體，包括D614G取代[WA1/D614G]）的強(qiáng)大抗體結(jié)合和中和反應(yīng)，類似于S-mi3引發(fā)的滴度（圖2B和2C）。相反，在初次接種后，沒有檢測到可溶性S蛋白免疫的中和抗體反應(yīng)。增強(qiáng)后，S-EABR eVLPs和S-mi3引發(fā)的中和抗體滴度增加了>10倍，比可溶性S的滴度高出>20倍（圖2C）。

S-EABR eVLP引發(fā)了針對(duì)S蛋白受體結(jié)合域（RBD）的有效抗體反應(yīng)（圖S2C），S蛋白是抗SARS-CoV-2中和抗體的主要靶標(biāo)。還通過斑塊減少中和試驗(yàn)（PRNT）評(píng)估了血清對(duì)真實(shí)的SARS-CoV-2的反應(yīng)，顯示出對(duì)SARS-CoV-2 WA1的強(qiáng)大中和活性（圖S2D）。中和滴度下降對(duì)SARS-CoV-2β和德爾塔變異株的抵抗力分別為2倍，這與編碼SARS-CoV-2-WA1S蛋白的許可疫苗的研究一致。這些結(jié)果表明，純化的S-EABR eVLP可在體內(nèi)引發(fā)有效的免疫反應(yīng)，并代表了一種生產(chǎn)納米顆粒疫苗的替代技術(shù)，該疫苗不涉及洗滌劑介導(dǎo)的細(xì)胞裂解和從細(xì)胞裂解物中分離膜蛋白抗原。

三、mRNA編碼的S-EABR構(gòu)建體誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)和eVLP出芽

與現(xiàn)有的基于納米顆粒的疫苗方法相比，EABR-eVLP技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是S-EABR構(gòu)建體可以很容易地作為mRNA疫苗遞送，因?yàn)閑VLP組裝和細(xì)胞表面表達(dá)都只需要表達(dá)單個(gè)基因編碼的成分。雖然傳統(tǒng)的新冠肺炎mRNA疫苗通過S蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，信使核糖核酸介導(dǎo)的S-EABR構(gòu)建體的遞送可以增強(qiáng)B細(xì)胞的激活，因?yàn)镾-EABR蛋白不僅會(huì)在細(xì)胞表面表達(dá)，還會(huì)誘導(dǎo)從細(xì)胞中出芽并分布在體內(nèi)的eVLP的組裝，以激活免疫細(xì)胞。

為了研究S-EABR-eVLP的基因編碼是否能增強(qiáng)基于嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型S的mRNA疫苗的效力，研究人員首先合成了編碼S、S-EABR、S-EPM或S-EABR/no-EPM的核苷修飾的mRNA。在HEK293T細(xì)胞中體外轉(zhuǎn)染mRNAs 48小時(shí)后，通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析評(píng)估細(xì)胞表面表達(dá)和eVLP組裝，表明與S-EABR融合蛋白相比，S的表面表達(dá)更高（圖3B）。雖然添加EPM對(duì)S表面表達(dá)幾乎沒有影響，但去除EPM降低了S-EABR構(gòu)建體的表達(dá)水平。上清液的Western blot分析證實(shí)，S和S-EPM轉(zhuǎn)染在上清液中未產(chǎn)生可檢測的eVLP，而在S-EABR轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中明顯檢測到eVLP（圖3C）。S-EABR/no-EPM的eVLP產(chǎn)生減少，這與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖3B）一起表明，添加EPM增強(qiáng)了S-EABR細(xì)胞表面表達(dá)和eVLP組裝。

四、與傳統(tǒng)疫苗相比，S-EABR信使核糖核酸LNP可引發(fā)更高的抗體滴度

1、在BALB/c小鼠中評(píng)估eVLP產(chǎn)生對(duì)mRNA疫苗效力的影響。

如新冠肺炎mRNA疫苗在小鼠中的臨床前研究所述，在第0天和第28天以2 mg mRNA的劑量肌肉內(nèi)（IM）施用mRNA-LNP。mRNA LNP免疫也與在Addavax佐劑存在下注射IM的純化的S-EABR eVLP進(jìn)行比較。prime后，S和S-EABR mRNA LNP引發(fā)的針對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白的抗體結(jié)合反應(yīng)明顯高于純化的S-EABR eVLP（圖4B）。然而，最高的中和抗體滴度是由純化的S-EABR eVLP引起的，其顯著高于由S mRNA LNP引起的滴度（圖4C）。

S-EABR mRNALNP的幾何平均中和滴度分別比純化的S-EABR eVLP和S mRNA LNP引發(fā)的滴度高5.1倍和5倍（圖4C和4D）。增強(qiáng)后3個(gè)月（第112天），與純化的S-EABR eVLP和S mRNA LNP相比，S-EABR mRNA LNP的平均中和滴度分別高5.9倍和6.8倍，表明血清中和活性的增加是持續(xù)性的。

2、評(píng)估血清對(duì)SARS-CoV-2揮發(fā)性有機(jī)物的中和活性。

與S mRNA LNP相比，S-EABR mRNA LNP在第56天和第112天分別引發(fā)了4.9倍和6.5倍的針對(duì)Delta變體的平均中和反應(yīng)，以及4.6倍和9.4倍的滴度。針對(duì)奧密克戎BA.1，除接受S-EABR mRNA LNP的小鼠外，所有組的中和抗體反應(yīng)均顯著下降，在第56天和第112天，該小鼠的中和滴度分別比S mRNA LNP高15.1倍和9.5倍，比純化的S-EABR eVLP高20.7倍和15.4倍。

這些結(jié)果說明，與傳統(tǒng)的基于信使核糖核酸和蛋白質(zhì)納米顆粒的疫苗方法相比，信使核糖核酸介導(dǎo)的S-EABR eVLP的遞送增強(qiáng)了小鼠體液免疫反應(yīng)的效力和廣度。觀察到的對(duì)基于奧密克戎的揮發(fā)性有機(jī)物的中和活性的改善顯著大于最近批準(zhǔn)的二價(jià)mRNA加強(qiáng)針的1.5倍，這表明基于S-EABR mRNA-LNP的加強(qiáng)免疫可以誘導(dǎo)比當(dāng)前新冠肺炎疫苗更有效和持久的對(duì)基于奧密克戎和新出現(xiàn)的揮發(fā)性有機(jī)化合物的免疫力。

五、S-EABR mRNA LNP誘導(dǎo)強(qiáng)大的T細(xì)胞反應(yīng)

在第112天（增強(qiáng)后3個(gè)月），從免疫小鼠中分離脾細(xì)胞，通過酶聯(lián)免疫吸附點(diǎn)（ELISpot）測定分析T細(xì)胞反應(yīng)。用一組SARS-CoV-2 S特異性肽刺激脾細(xì)胞，并測量INF-g和IL-4的分泌以評(píng)估T細(xì)胞的活化。編碼S和S-EABR構(gòu)建體的mRNA LNP誘導(dǎo)了有效的INF-g反應(yīng)，與S特異性細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和T輔助因子1（TH1）細(xì)胞免疫反應(yīng)一致。相反，用純化的S-EABR eVLP免疫的小鼠幾乎檢測不到INF-g反應(yīng)。這些結(jié)果是預(yù)期的，因?yàn)閙RNA LNP免疫導(dǎo)致S或S-EABR免疫原的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和激活CD8+T細(xì)胞的抗原肽的MHC I類呈遞，這在基于蛋白質(zhì)納米顆粒的疫苗中并不常見。

與S mRNA LNP和純化的S-EABR eVLP相比，S-EABR mRNA LNP誘導(dǎo)了顯著更強(qiáng)的IL-4反應(yīng)，與強(qiáng)大的TH2細(xì)胞免疫反應(yīng)一致。雖然對(duì)S mRNA LNP和純化的S-EABR eVLP分別觀察到TH1-和TH2-偏向性反應(yīng)，但S-EABR mRNA LNP誘導(dǎo)了平衡的TH1/TH2反應(yīng)，從而有效刺激細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。因此，S-EABR mRNA LNP保留了傳統(tǒng)S mRNA LNP激活強(qiáng)效細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力，同時(shí)也有效激活TH2 CD4+T細(xì)胞反應(yīng)以增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，從而提高抗體的效力和廣度。

六、結(jié)論

與現(xiàn)有的基于蛋白質(zhì)納米顆粒的疫苗方法相比，采用參與細(xì)胞分裂病毒出芽的 ESCRT 通路來驅(qū)動(dòng) eVLP 的組裝和釋放，可產(chǎn)生更高數(shù)量的 eVLP 。EABR 技術(shù)表現(xiàn)出更加吸引人的特征：

√  eVLP生產(chǎn)只需要表達(dá)單個(gè)組分

√ 跨膜蛋白保留在其天然膜相關(guān)構(gòu)象中，以確保最佳的蛋白質(zhì)表達(dá)和穩(wěn)定性，

√ 完全組裝的eVLP可以直接從培養(yǎng)上清液中純化，而不需要洗滌劑介導(dǎo)的細(xì)胞裂解和從細(xì)胞裂解物中分離膜蛋白抗原。