RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效特異的基因缺失性研究工具，是Andrew Fire 和Craig Mello在線蟲中發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導的基因沉默現(xiàn)象，幾乎存在于所有真核生物中。RNAi已經(jīng)廣泛應用于各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選。近年來，多種臨床試驗表明靶向致病基因的RNAi藥物具有治療困擾人類多年疾病的巨大潛力。

一、RNA干擾的作用機制

RNA干擾是將雙鏈RNA導入細胞引起特異基因RNA降解的一種細胞反應過程,涉及多種蛋白質(zhì)共同參與。雙鏈RNA進入細胞內(nèi)后，會被核酶切割成只有21-23nt的小分子RNA片段，即siRNA，隨后的siRNA與細胞質(zhì)內(nèi)的RNA誘導沉默復合體（RISC）結(jié)合，并解旋成單鏈。其中的正義鏈會被降解，剩下的反義鏈會引導RISC與相應互補的mRNA結(jié)合，致使RISC切斷這段mRNA并使其降解，以導致其無法翻譯出蛋白質(zhì)或調(diào)控基因表達。在研究基因功能中，RNAi由于可以特異性地使基因沉默或表達量降低而成為生物實驗中的有力工具。

二、RNA干擾的類別

1.siRNA：(short/small interfering RNAs)合成：原理：在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3'端12個堿基的位置切割mRNA。
對于常規(guī)的編碼基因，轉(zhuǎn)錄出的mRNA基本都是定位在細胞質(zhì)中。對于這種基因的干擾，可以化學合成雙鏈siRNA，即dsRNA。dsRNA通常21～25bp，短小精悍，很容易被轉(zhuǎn)染到目的細胞（系）中，但是缺點就是不能穩(wěn)定遺傳下去。
2.microRNA（miRNA，微小 RNA）干擾載體構(gòu)建：miRNA是由內(nèi)源性發(fā)夾（hairpin）結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物衍生而來的一種長為 19 nt~25 nt 的單鏈 RNA。在每種高等動物中，存在 200 種以上的 miRNA，是最大的基因家族之一，約占基因組的 1%。單鏈RNA主要采用Pol II啟動子表達人工設(shè)計的微小RNA（miRNA）互補鏈或多個miRNA互補鏈，靶向干擾成熟miRNA。
3.shRNA (RNA-Short hairpin RNAs)干擾載體構(gòu)建：即短發(fā)夾 RNA，是設(shè)計為能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小 RNA 分子，可通過 RNA 干擾來抑制基因的表達。Thomas Rosenquist 和 Greg Hannon 小組聯(lián)合研究了在哺乳動物種系細胞中 shRNAs 的轉(zhuǎn)移導致基因長時間穩(wěn)定沉默的機制。shRNA是可以克隆至表達載體并表達siRNA雙鏈的DNA分子。
可以根據(jù)目標基因設(shè)計短發(fā)卡RNA序列并將其克隆到特定載體上。

         miRNA，siRNA，dsRNA 和 shRNA 都是 RNA 干擾技術(shù)中用到的小分子 RNA，其不同之處在 miRNA 是單鏈 RNA，其余均為雙鏈 RNA；siRNA 和 dsRNA 相似；shRNA 需通過載體導入細胞后，然后利用細胞內(nèi)的酶切機制得到 siRNA 而最終發(fā)揮 RNA 干擾作用。
三、shRNA常用載體
shRNA常用載體有pLk0.1-U6-ShRNA-Puro和pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro載體，
1. pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro其圖譜和元件特點如下所示：1.1慢病毒表達載體，可以用于瞬轉(zhuǎn)或慢病毒包裝；
1.2 含H1-promoter用于表達shRNA序列；
1.3 帶有GFP和Puro雙標簽，可用于檢測轉(zhuǎn)染效率和抗性篩選

2.PLK0.1-U6-shRNA-hPGK-GFP-Puro其圖譜和元件特點如下所示2.1.慢病毒表達載體，可以用于瞬轉(zhuǎn)或慢病毒包裝；
2.2含U6-promoter用于表達shRNA序列；
2.3.Puro和GFP雙標簽，用于熒光觀察和抗性篩選

其他干擾載體及元件：

四、shRNA引物設(shè)計
1.數(shù)據(jù)庫介紹：
以人RNF24基因為例，用pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro作為載體為例，敲減人RNF24基因（基因ID：11237），GPP Web Portal：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/gene/search，選擇Search by Gene如圖所示：

2.  輸入基因ID，點擊Search，如圖所示：

3.點擊“Show all constructs for this list of genes, e.g. sgRNA, shRNA or open reading frames (ORFs)”下拉找到推薦的靶點序列，如圖所示：

4、添加酶切位點和Loop環(huán)結(jié)構(gòu)：
繼續(xù)以上述人RNF24基因為例，在數(shù)據(jù)庫選取某個干擾靶點：GCCTACAAACAGGTTATATTA在該序列兩端加上酶切位點，中間插入Loop環(huán)，設(shè)計shRNA片段
正反向Oligo序列分別為：
RNF-shRNA 1 -F:5’-GATCCGCCTACAAACAGGTTATATTACTCGAGTAATATAACCTGTTTGTAGGCTTTTTG-3’
RNF-shRNA 1 -R
5’-AATTCAAAAAGCCTACAAACAGGTTATATTACTCGAGTAATATAACCTGTTTGTAGGCG-3’
將該Oligo片段正反向混合退火后，即可直接與載體進行連接，構(gòu)建shRNA干擾載體。