WWW.DJDJ66.COM,WWW.EX958,COM

產(chǎn)品描述

細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)輔助試劑是配套基恩科生物GB系列載體，進(jìn)行目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建使用，將細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)輔助試劑與目的基因表達(dá)載體混合后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，抗性篩選篩選后進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系細(xì)胞系構(gòu)建，主要應(yīng)用于長片段基因（CDS≥4kb）的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建。

【穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建流程】
以12孔板為例，建議12孔板進(jìn)行實(shí)驗，以Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞為例。

細(xì)胞鋪板：

轉(zhuǎn)染前一天（20-24 小時），將胰酶消化后的細(xì)胞按照每孔 0.5-2×105 個細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板（不含抗生素），使其在轉(zhuǎn)染時密度為 85-95%。

轉(zhuǎn)染：

將目的基因表達(dá)載體或?qū)φ諢晒廨d體與穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑混合后轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，穩(wěn)轉(zhuǎn)輔助試劑、表達(dá)載體用量參考下表，具體轉(zhuǎn)染步驟參考轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。
表1 細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)輔助試劑、表達(dá)載體、培養(yǎng)基用量

細(xì)胞培養(yǎng)板	表面積	輔助試劑用量（uL）	表達(dá)載體用量（ug）	培養(yǎng)基用量
12孔板	2cm2	0.25uL	0.75ug	1mL
6孔板	10cm2	1.25uL	3.75ug	2mL
60cm培養(yǎng)皿	20cm2	2.5uL	7.5ug	4mL

（3）擴(kuò)大培養(yǎng)：
轉(zhuǎn)染后12h，換新鮮培養(yǎng)基，48h進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞貼壁后加入1-2.5ug/ml嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基（不同細(xì)胞Puro篩選濃度不同，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗進(jìn)行Puro IC50驗證），同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的陰性對照，連續(xù)篩選培養(yǎng)3天，陰性對照組細(xì)胞全部凋亡，將抗生素濃度降至一半繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，可通過熒光進(jìn)行過表達(dá)感染效率觀察。
注：目的基因有弱啟動子熒光表達(dá)，熒光強(qiáng)度比較弱，可適當(dāng)將熒光強(qiáng)度調(diào)大后觀察。
（4）繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)：
檢測目的基因的表達(dá)水平（QPCR、WB或流式），傳代培養(yǎng)檢監(jiān)測目的基因的表達(dá)穩(wěn)定性。
（5）可選做：
單克隆鑒定，分離單克隆細(xì)胞，接種于96孔板中（每個96孔板按90-100個細(xì)胞接種，每孔平均1個細(xì)胞），待細(xì)胞形成克隆，消化，裂解部分細(xì)胞進(jìn)行基因型鑒定，陽性克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得單克隆細(xì)胞株。
注：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株如傳代次數(shù)較多，過表達(dá)效率變低，可用適當(dāng)濃度的嘌呤霉素再次篩選，富集穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

相關(guān)產(chǎn)品

亚洲欧美不卡高清在线-日韩无码精品视频夜夜操-国产成人精品亚洲男人的天堂-欧洲av色爱无码综合网-理论片第一页一区二区

細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)輔助試劑