lncrna是一類長度＞200nt的非編碼rna，以前被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪聲”?，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，其中一些lncrna在基因表達(dá)中具有多種調(diào)節(jié)作用，可以作為形成核組織的結(jié)構(gòu)成分，甚至可以作為其他rna或蛋白質(zhì)的誘餌實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控。雖然數(shù)以萬計(jì)的lncRNA轉(zhuǎn)錄本已經(jīng)通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)lncRNA的生物學(xué)功能都未知。為了更好的研究LncRAN的功能，過表達(dá)，敲低，敲除等表達(dá)調(diào)控策略為其研究的常用技術(shù)。本文主要闡述如何高效的敲低LncRNA。LncRNA敲低常用的策略有三 種，分別是RNA干擾(RNAi)、CRISPR-Cas系統(tǒng)基因組編輯和反義寡核苷酸。

為了更高效的進(jìn)行LncRNA敲低，不同LncRNA需要采用不同的策略。首先需要確定LncRNA的定位，因?yàn)榇蟛糠諰ncRNA位于細(xì)胞核中，亞細(xì)胞定位一般通過FISH實(shí)驗(yàn)或lncLocator2，lncATLAS等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測。 其次是通過LncRNA和基因組分析，LncRNA屬于基因間LncRNA，內(nèi)含子LncRNA，正義LncRNA和反義LncRNA中的那種類型。

方法1：通過RNAi進(jìn)行LncRNA的敲低

RNAi是基因敲低調(diào)控中最長用的工具，但是因?yàn)镽NAi介導(dǎo)的RNA降解主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，因此當(dāng)LncRNA定位于細(xì)胞質(zhì)中時(shí)優(yōu)先選擇RNAi的方法。因此該方法主要用于定位于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNAs。

方法二：CRISPR/Cas系統(tǒng)用于LncRNA的敲除和敲低

CRISPR/Cas9主要通過NHEJ產(chǎn)生小的indel造成移碼突變，使mRNA翻譯被破壞，敲除目的基因。但是LncRNA不存在ORF開放閱讀框，無法通過單靶點(diǎn)有效敲除LncRNA，只能通過雙靶點(diǎn)（dual-sgRNA）進(jìn)行大片段基因敲除，通過單克隆篩選大片段敲除純合克隆，成功實(shí)現(xiàn)LncRNA的敲除。但是如果LncRNA屬于基因間LncRNA，大片段敲除會(huì)同時(shí)敲除其他基因，不能采用此方法。

Cas13家族的Cas13a, Cas13b和Cas13d均被證實(shí)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中RNA靶向切割，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。其中Cas13d家族蛋白CasRx因?yàn)轶w積小，效率高，脫靶率低等被用于RNA的靶向沉默，可以通過慢病毒實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平LncRNA靶向沉默，也可通過AAV病毒實(shí)現(xiàn)體內(nèi)LncRNA的靶向沉默。

CRISPR干擾(CRISPRi)的不斷成熟和簡便，通過CRISPRi技術(shù)可以有效的對(duì)LncRNA進(jìn)行敲低，包括可以通過文庫構(gòu)建適用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模遺傳篩選。

方法三:   反義寡核苷酸（ASO，Antisense Oligonucleotide ）

反義寡核苷酸通常被稱為Gapmers，是合成的和嵌合的單鏈寡核苷酸，通過招募和激活內(nèi)切酶RNase H結(jié)合并切割互補(bǔ)RNA, gapmers通常包含一個(gè)中心DNA部分，兩側(cè)是修飾的寡核苷酸，如2’- o -甲基RNA (2’OMe)，并鎖定DNA-RNA，復(fù)合物被RNase H識(shí)別，并激活RNase H，進(jìn)行切割。由于RNase H在細(xì)胞核中最為豐富，因此通過反義寡核苷酸策略可有效敲低細(xì)胞核中的LncRNA。有研究表明ASO認(rèn)為ASO更容易入核，適合核內(nèi)RNA干擾，示，針對(duì)主要位于核內(nèi)的MALAT1，ASO有著較好的抑制效果胞質(zhì)LncRNA效果比較差。

總之，對(duì)于LncRNA的下調(diào)，根據(jù)LncRNA基因定位和在基因組的分布，不同的LncRNA選擇不同的操作工具可以達(dá)到事半功倍的效果?；骺粕锾峁┒喾N載體和病毒方案，供您構(gòu)建LncRNA下調(diào)細(xì)胞模型。