細(xì)胞系基因編輯是基因編輯和修飾里面效率最高、最簡(jiǎn)便、成本最低、最容易上手的技術(shù)之一。CRISPR-CAS9是細(xì)菌防御病毒的一種手段，病毒作為外來物病毒DNA進(jìn)入細(xì)菌時(shí)，它會(huì)被加工成更小的片段，可能會(huì)被插入細(xì)菌基因組的一個(gè)被稱為CRISPR位點(diǎn)的區(qū)域，當(dāng)該區(qū)域被轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)物與稱為tracrRNA的小RNA結(jié)合，將CAS9蛋白和RNA定位到分子上。

每個(gè)復(fù)合物都由CAS9蛋白、tracrRNA和gRNA組成。這些結(jié)構(gòu)中的crRNA識(shí)別并引導(dǎo)CAS9切開病毒DNA。科學(xué)家們通過模仿tracrRNA和crRNA的單個(gè)RNA分子（gRNA）使用CRISPR-CAS9系統(tǒng)。例如當(dāng)倆個(gè)這樣的引導(dǎo)RNA被引入到CAS9的細(xì)胞中并且都針對(duì)相同的基因時(shí)一個(gè)序列可以被切除，一旦這個(gè)目標(biāo)區(qū)域被移除，切斷的末端會(huì)發(fā)生非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)或者同源定向修復(fù)（HDR）。

一、細(xì)胞株基因敲除實(shí)驗(yàn)流程：

基因敲除離不開基因編輯系統(tǒng)，在人工構(gòu)建的CRISPR-CAS9系統(tǒng)載體中，crRNA+tracrRNA融合為一條，稱為導(dǎo)向RNA（guide RNA，gRNA），我們常說的gRNA其實(shí)就是crisprRNA中識(shí)別宿主靶點(diǎn)的序列。

二、雙靶點(diǎn)sgRNA敲除細(xì)胞株的兩種類型

經(jīng)過編輯的細(xì)胞系經(jīng)挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)生基因編輯的細(xì)胞株基因組切斷的末端會(huì)發(fā)生非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)或者同源定向修復(fù)（HDR）。對(duì)于敲出片段的大小不同，會(huì)有以下兩種情況：

1.移碼敲除：敲除的細(xì)胞株因NHEJ會(huì)在兩個(gè)sgRNA的切割位置引indels，與野生型未敲除的基因組相比，外顯子區(qū)域插入或缺失的堿基數(shù)為非3整數(shù)倍會(huì)導(dǎo)致閱讀框的移碼，導(dǎo)致該基因被敲除。

2.精確的片段敲除：敲除的細(xì)胞株在切割位點(diǎn)發(fā)生精確切割且無indels引入，也無同源定向修復(fù)（HDR），最終基因組切割片段與設(shè)計(jì)的切割片段完全吻合。

三、雙靶點(diǎn)sgRNA基因敲除如何PCR鑒定？

PCR鑒定雙靶點(diǎn)sgRNA基因敲除的基本原則是利用基因敲除株基因組與野生型基因組的序列差異，以基因敲除株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，并以凝膠電泳對(duì)比不同基因型特異產(chǎn)物的大小，根據(jù)條帶大小來初步區(qū)分不同基因型。

1：junction引物設(shè)計(jì)

將引物設(shè)計(jì)在敲除區(qū)域的內(nèi)外側(cè)，即一條引物位于敲除片段內(nèi)側(cè)，一條引物位于敲除片段外側(cè)。該對(duì)引物可用于敲除細(xì)胞株的初步篩選，篩除敲除片段仍然存在的未編輯克隆。較短的敲除片段，例如敲除大小＜60bp，NHEJ引入的indels會(huì)使得junction引物其中的一條的模板大概率發(fā)生改變，從而使得juntion引物無法擴(kuò)增出目的條帶。

2：KO引物設(shè)計(jì)

將引物設(shè)計(jì)在敲除區(qū)域的上下游外側(cè)，即兩條引物位于敲除片段不同外側(cè)。該對(duì)引物可用于檢測(cè)敲除細(xì)胞株敲除片段是否被精確敲除。較短的敲除片段，KO片段需經(jīng)過測(cè)序及生信分析得到最終編輯結(jié)果。

舉例說明：

如上圖所示，A基因敲除大小為156 bp，外顯子敲除106 bp。

設(shè)計(jì)的junction引物位于敲除片段內(nèi)外側(cè)，野生型為模板的junction F/R擴(kuò)增產(chǎn)物大小為281 bp。

設(shè)計(jì)的KO引物位于敲除片段兩端外側(cè)，野生型為模板的 KO F/R擴(kuò)增產(chǎn)物大小為426 bp，被敲除的基因組模板為426 bp減去156 bp為270bp。

實(shí)際檢測(cè)結(jié)果如下圖所示：

16號(hào)單克隆細(xì)胞株Junction引物PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性，表明16號(hào)克隆很有可能發(fā)生了編輯。

結(jié)合KO引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷，16號(hào)單克隆細(xì)胞株KO引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物略大于250bp marker，符合敲除后270 bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小，下一步可進(jìn)行膠回收送測(cè)序，進(jìn)一步確定其基因型。

四、雙靶點(diǎn)sgRNA基因敲除PCR鑒定操作步驟

（1）檢測(cè)敲除的混合克隆樣本；

使用按照上述方法設(shè)計(jì)的引物對(duì)基因敲除的細(xì)胞系進(jìn)行混合克隆PCR初步鑒定。

將適量的混合克隆細(xì)胞（1～10萬個(gè)細(xì)胞）移入1.5mL的離心管中，8000 rpm/min 離心5min左右，棄掉培養(yǎng)基（此處不應(yīng)殘留培養(yǎng)基），加入約100ul的細(xì)胞快速裂解液（GC231000459），吹打均勻。將分散有細(xì)胞的裂解液水浴55℃ 30min,95℃ 10min。即可制備出可用于基因敲除PCR鑒定使用的基因組模板。

如果瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到符合敲除后的KO引物擴(kuò)增大小的條帶，則說明此處極大發(fā)生了基因編輯，經(jīng)測(cè)序后即可驗(yàn)證即此混合克隆樣本中是否發(fā)生敲除，如果混合克隆發(fā)生了敲除編輯，則可進(jìn)入下一步單克隆細(xì)胞株篩選；如果只有JC擴(kuò)增產(chǎn)物條帶和未敲除的KO引物擴(kuò)增大小，則說明此處未發(fā)生基因編輯或發(fā)生編輯細(xì)胞在混合克隆樣本中的占比極低，即此混合克隆沒有敲除效率或挑到相應(yīng)純合克隆細(xì)胞株的概率極低。

舉例說明：

B基因雙gRNA敲除片段大小為862 bp，KO引物在未編輯基因組上擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1256bp，使用未編輯的野生型細(xì)胞裂解液模板作為KO引物的陽(yáng)性對(duì)照。

如果混合克隆中大量細(xì)胞發(fā)生了基因編輯，雙gRNA編輯的混合克隆裂解液模板的擴(kuò)增條帶大小應(yīng)為1256bp減去862bp，即394bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察到符合敲除后KO擴(kuò)增產(chǎn)物大小的目的條帶。

回收目的條帶送測(cè)后，進(jìn)一步確定，該條帶確為雙gRNA發(fā)生精確切割后的KO條帶，證明混合克隆中發(fā)生了大規(guī)模的敲除編輯事件。

（2）將有敲除效率的混合克隆做單克隆細(xì)胞株篩選并驗(yàn)證。

將上一步有敲除效率的混合克隆用有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選。單克隆細(xì)胞株生長(zhǎng)至適宜細(xì)胞數(shù)量即可進(jìn)行PCR鑒定。單克隆篩選的模板裂解方式和程序可參考混合克隆。

由于在篩選單克隆時(shí)存在樣本數(shù)量較大，操作耗時(shí)長(zhǎng)等問題，我公司的細(xì)胞快速裂解液能夠解決這些問題，樣本裂解迅速、快捷，制備的樣品模板實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

首先推薦使用junction引物對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行篩選，以排除大量的雜合子和未編輯細(xì)胞株。

其次，對(duì)Junction引物擴(kuò)增陰性的單克隆樣本再使用KO引物進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)敲除片段的大小，以及實(shí)際上可能出現(xiàn)的敲除方式進(jìn)行檢測(cè)（精確敲除或移碼突變）。

舉例說明：C基因和D基因的單克隆經(jīng)juntion引物初篩后，進(jìn)行juntion引物擴(kuò)增復(fù)檢和KO擴(kuò)增，出現(xiàn)與敲除后KO擴(kuò)增條帶大小吻合的目的條帶，這類目的條帶即可進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生信分析，結(jié)果表明D基因敲除的1號(hào)單克隆細(xì)胞株為敲除純合子。

后續(xù)也可進(jìn)行Western Blot進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，但Western Blot結(jié)果陰性只能作為敲除成功的充分條件而非必要條件。

五、基恩科生物提供基于sgRNA敲除的相關(guān)產(chǎn)品