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產(chǎn)品描述

【產(chǎn)品概述】

本產(chǎn)品是使用SYBR GreenI 嵌合熒光法進行qPCR的專用試劑。核心組分是基于化學法修飾的熱啟動DNA聚合酶，配合針對qPCR優(yōu)化的反應緩沖液，可以有效抑制非特異性擴增，顯著提高擴增效率，從而對靶基因進行準確定量。同時，本產(chǎn)品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)更準確。本產(chǎn)品為2 ×預混試劑，使用時只需加入模板、引物、ROX Reference Dye（根據(jù)qPCR儀選擇）和水，使其工作濃度為1×，即可進行反應。

【產(chǎn)品特點】

1.使用化學法修飾的熱啟動酶，提高靈敏度，增強特異性；

2.使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前擴增產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)更準確；

3.針對qPCR優(yōu)化的反應緩沖液，增強特異性，提高擴增效率，重復性好，可信度高；
4.配有適用于不同機型的ROX Reference Dye（調(diào)整PCR加樣誤差引起的管間差異），數(shù)據(jù)準確。

【產(chǎn)品組成】

Component	GC231000561-01(500rxn/20 μlreaction)	GC231000561-02(2500rxn/20 μl reaction)
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDGa	4×1.25 ml	5×GC231000561-01
50×ROX Reference Dye Ib	200 μl
50×ROX Reference Dye IIb	200 μl

1. a.包含熱啟動酶，UDG酶，dNTPs，dUTP，Mg2 + ，SYBR GreenI 等
2. b.用以校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差。不同機型ROX Reference Dye使用情況參見下表：

無需添加ROX Reference Dye	Bio-Rad iCycler CFX96, CFX384, iQ, iQ5,MyiQ, Opticon, Opticon 2,MiniOpticon, Chromo4; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor- Gene 6000; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scienti?c PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR; Takara TP-800.




添加ROX Reference Dye I（終濃度為1×）	Applied Biosystems 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne, StepOnePlus.

添加ROX Reference Dye II（終濃度為1×）	Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA7; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000.

【推薦qPCR體系（以20 μl反應體系為例）】

Component	Volume	Final Concentration
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG	10 μl	1×
10 μM Forward Primer	0.4 μl	0.2 μM
10 μM Reverse Primer	0.4 μl	0.2 μM
50×ROX Reference Dye (optional)	0.4 μl	1×
PCR-grade Water	Variable	-
Template	Variable	As Required
Total Volume	20 μl	-

反應體系中各成分的量可根據(jù)以下原則進行調(diào)整：

1.反應體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴增效果,當反應性能較差時，引物終濃度可以在0.1 - 0.5 μM范圍內(nèi)進行調(diào)整;

2.qPCR靈敏度極高，建立反應體系時加入模板量的準確度對最終結(jié)果會有很大的影響;推薦將模板稀釋后加入反應體系中，這樣可以有效提高實驗的重復性;

3.如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。

【PCR條件】

a.退火/延伸時間請根據(jù)您使用的Real-time PCR儀所需要的數(shù)據(jù)采集最短時間限制自行調(diào)整: 使用ABI 7700和7900時至少30秒；使用ABI 7000和7300時至少31秒；使用ABI 7500時至少34秒；
b.儀器類型不同，融解曲線采集程序不盡相同，使用儀器默認融解曲線采集程序即可。

【注意事項】

1.本品盡量避免反復凍融，以免酶活下降。如每次使用量較少，推薦分裝后保存；

2.使用前請上下顛倒混勻預混液，請勿渦旋以免產(chǎn)生過多氣泡引起反應體系體積變化，進而影響定量結(jié)果；預混液經(jīng)混勻瞬時離心后即可使用；

3.由于本品含有熒光染料SYBR GreenI，因此保存預混液，以及配制反應體系時都應盡量避免強光照射；

4.由于本品檢測靈敏度極高，在配制過程中請使用干凈滅菌槍頭、反應管，條件容許的實驗室推薦使用專用的移液器，避免污染。

【常見問題與解決方案】

1.陰性對照中有信號產(chǎn)生
a.模板或試劑被核酸污染：在進行PCR反應前采取標準的預防措施，以降低污染風險；
b.產(chǎn)生引物二聚體：配合融解曲線進行分析。
2.融解曲線出現(xiàn)多個峰
a.存在引物二聚體或其他特殊結(jié)構(gòu)：根據(jù)設計原則設計合成新的引物；
b.引物濃度太高：適當降低引物濃度；
c.cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板。
3.定量PCR無擴增曲線
a.反應循環(huán)數(shù)不夠：一般設置循環(huán)數(shù)為40；
b.確認程序中是否設置了信號采集步驟：兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段；
c.確認引物是否降解：長時間未使用的引物可能發(fā)生降解，合成新的引物，重復實驗；
d.模板濃度太低：減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品按最高濃度進行檢測；
e.模板降解：重新制備模板，重復實驗。

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