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產(chǎn)品描述

【產(chǎn)品概述】
基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴于繁瑣的酶切、回收、連接等操作，通過DNA片段與線性化載體末端的15~25 nt同源序列的重組，可將DNA片段克隆至任意線性化載體任意位點(diǎn)，載體自連背景極低。無縫克隆技術(shù)是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。 Exon Art Seamless Cloning and Assembly Kit 作為升級(jí)版的無縫克隆及多片段重組試劑盒，一個(gè)反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)DNA片段的重組，且陽性率高于95%。

【適用范圍】
基因定向克隆，多片段重組。

【實(shí)驗(yàn)流程圖】

【GeneCarer Seamless Cloning and Assembly試劑盒實(shí)驗(yàn)方案】

1. 線性化載體制備

采用酶切或反向PCR擴(kuò)增方法將載體線性化。

a. 酶切制備：

選擇合適的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可。若使用單酶切進(jìn)行線性化，可以適當(dāng)延長酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。酶切完成后，應(yīng)將限制性內(nèi)切酶失活或?qū)€性化載體純化后再用于重組反應(yīng)。

注1 : 載體酶切一定要完全，否則未切開的載體會(huì)影響后續(xù)陽性克隆的鑒定；
注2 : 經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化。

b. 反向PCR擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真的聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用線性化質(zhì)粒做模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對(duì)后續(xù)陽性克隆的鑒定。

注：如果使用環(huán)狀質(zhì)粒做模板，應(yīng)使用DpnI對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行降解，再用于后續(xù)重組反應(yīng)。

2. 插入片段PCR引物設(shè)計(jì)

PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（其他插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推建使用20 nt）序列

插入片段正向擴(kuò)增引物：

5'-載體上游末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+基因特異性正向配對(duì)序列-3'

插入片段反向擴(kuò)增引物：

3'- 基因特異性反向配對(duì)序列+酶切位點(diǎn)（可選）+載體下游末端同源序列-5'

3. 插入片段PCR擴(kuò)增

推薦使用高保真的聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)。若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積應(yīng)不超過總反應(yīng)體積的20%。

4. 重組反應(yīng)

a. 配制以下反應(yīng)體系：

組分	反應(yīng)體系
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	5 μl
線性化載體	50~200 ng
插入片段	10~200 ng
Sterilized ddH2 O	補(bǔ)足至10 μl

重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吹打混勻各組分后進(jìn)行瞬時(shí)離心，避免氣泡產(chǎn)生，切勿渦旋。

注1 : 插入片段與載體在重組時(shí)為相同摩爾數(shù)；

注2 : 若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段與載體的摩爾比應(yīng)調(diào)整為5:1；

注3 : 當(dāng)1~2個(gè)DNA片段插入載體時(shí)，DNA總量推薦為0.02~0.5 pmols；當(dāng)4~6個(gè)DNA片段插入載體時(shí)，DNA總量推薦為0.2~1 pmols；

注4 : DNA摩爾數(shù)與質(zhì)量換算公式：pmols=(weight in ng)×1000/(base pairs×650 daltons) ；例如，200 ng的5000 bp載體為0.06 pmols；

注5 : 載體片段過長、插入片段過長或片段數(shù)過多，克隆數(shù)及陽性克隆率均會(huì)降低。

b. 將反應(yīng)體系置于50℃，反應(yīng)15~60 min。

注1：推薦使用PCR儀等溫控比較精確的儀器進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間不足或過長均會(huì)影響克隆效率；

注2：插入片段小于500 bp時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為15 min；

注3：插入片段在4 kb以上時(shí)，建議反應(yīng)時(shí)間為45~60 min；

注4：插入3~5個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為45~60 min。

c. 重組反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系進(jìn)行瞬時(shí)離心，置于冰上冷卻，用于轉(zhuǎn)化或者凍存于-20℃備用。

注：-20℃凍存的重組產(chǎn)物，建議在1周內(nèi)使用。

5. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10 μl重組產(chǎn)物，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30 min。42℃熱激90 sec，冰上放置3 min，加800 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45~60 min。將菌液均勻涂布在含有對(duì)應(yīng) 抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。

注：不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆數(shù)及克隆陽性率有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率大于108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞。

【常見問題】

問題描述	原因	解決方案
轉(zhuǎn)化效率低	感受態(tài)效率低下	使用新制備或經(jīng)驗(yàn)證的高效率感受態(tài)。

	DNA片段純度不夠	對(duì)載體和插入片段進(jìn)行膠回收純化。
	重組反應(yīng)抑制物	由于EDTA等金屬離子螯合劑會(huì)抑制重組反應(yīng)，因此純化產(chǎn)物應(yīng)溶解于無菌去離子水中，切勿使用Tris-EDTA 等緩沖液。

	DNA片段比例不佳	按照說明書推薦的最適用量和比例配制反應(yīng)體系。若線性化載體和插入片段已經(jīng)過純化，且電泳檢測條帶單一或無Smear殘留時(shí)，可使用NanoDrop等超微量核酸測定儀進(jìn)行測定，只有當(dāng)A260/A280在1.8~2.0之間時(shí)濃度值可信。


克隆陽性率低	載體線性化不完全	酶切制備線性化載體時(shí)，增加限制性內(nèi)切酶用量，延長酶切時(shí)間，使用膠回收純化酶切產(chǎn)物。

	相同抗性質(zhì)粒污染	以質(zhì)粒為模板進(jìn)行插入片段PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)使用已經(jīng)線性化的質(zhì)粒作為模板，使用DpnI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，在膠回收電泳過程中，應(yīng)使用新鮮的電泳緩沖液分離DNA片段，從而防止雜質(zhì)粒污染。

	平板抗性不足	使用新鮮制備的抗生素平板。
大量克隆含有不正確的插入片段	非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物	優(yōu)化PCR體系，提高擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。

【備注】
本產(chǎn)品僅供科研使用。在確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)問題時(shí)，本公司承諾為客戶免費(fèi)更換等量的合格產(chǎn)品。
在所有情況下，本公司對(duì)此產(chǎn)品所承擔(dān)的責(zé)任，僅限于此產(chǎn)品的價(jià)值本身。

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Genecarer Seamless Cloning and Assembly Kit