【產(chǎn)品概述】

基恩科（Gene carer）生物慢病毒包裝試劑盒（Lentiviral Packing Kit）由優(yōu)化的慢病毒包裝輔助質(zhì)粒混合物（Lentiviral Mix）,高效轉(zhuǎn)染試劑、慢病毒濃縮液，病毒感染增強(qiáng)劑四部分組成。適用于基因過表達(dá)或基因干擾的慢病毒的包裝，以及后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建。

【主要組成】

【自備試劑】：無菌水，PBS緩沖液，3%FBS+DMEM培養(yǎng)基，10%FBS+DMEM培養(yǎng)基

【收毒液配制】：收毒液：10%FBS+DMEM培養(yǎng)基+1%輔助收毒液A+1%輔助收毒液B（現(xiàn)配現(xiàn)用）

【運(yùn)    輸】：冰袋運(yùn)輸

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)】

1.慢病毒表達(dá)載體：基恩科慢病毒包裝試劑盒可以包裝Plenti-，Plvx，PCDH等系列慢病毒表達(dá)載體，psiH1-，plk0.1-等干擾表達(dá)載體。

2.表達(dá)載體質(zhì)量：無內(nèi)毒素提取慢病毒表達(dá)載體DNA，質(zhì)粒DNA溶于無菌的TE或ddH2O中，以紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之間，濃度≥500ng/uL。

3.細(xì)胞狀態(tài)：良好的細(xì)胞狀態(tài)對(duì)病毒的包裝至關(guān)重要，避免細(xì)胞培養(yǎng)基有細(xì)菌、真菌或支原體的污染，盡量使用傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，如果細(xì)胞是剛復(fù)蘇的話，最好傳兩代之后再包裝。

【實(shí)驗(yàn)步驟】：以10cm培養(yǎng)皿為例

1）293T細(xì)胞分盤：轉(zhuǎn)染前一天，將已經(jīng)長(zhǎng)好的細(xì)胞以合適比例傳代到10cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到60%-80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

2）轉(zhuǎn)染前換液：轉(zhuǎn)染前1～2h將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基（3%FBS+DMEM培養(yǎng)基），12mL/10cm皿。（注意：293T細(xì)胞貼壁性不是很好，換液時(shí)應(yīng)小心滴加盡量避免沖起細(xì)胞。）

3）轉(zhuǎn)染：取無菌的15mL離心管，加入1.5ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按下列組分配制反應(yīng)體系：

加入30ul高效轉(zhuǎn)染試劑A液（組分2），混勻。室溫放置15～20min后，均勻滴加到提前換過液的培養(yǎng)皿中，緩慢搖勻培養(yǎng)皿使轉(zhuǎn)染試劑均勻分布后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）換液：轉(zhuǎn)染18～20 h后，小心吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液棄于盛有消毒液的廢液杯中（注意：此時(shí)培養(yǎng)基中已含有少量的病毒，必須經(jīng)處理后才能丟棄，所用的移液槍頭等必須經(jīng)消毒液浸泡處理后才能丟棄），加10mL新鮮的收毒液繼續(xù)培養(yǎng)。

5）病毒收集：換液24h后，吸取細(xì)胞上清液于50mL離心管（4℃保存），加10mL新鮮的收毒液繼續(xù)培養(yǎng)。換液24h后，吸取細(xì)胞上清液于前一次離心管中，4℃，500g離心5min，上清液用0.45μm濾器過濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并確定過濾后病毒上清液體積。

6）病毒濃縮：將慢病毒濃縮液（5×）按照1：4的比例添加到過濾后的病毒上清液中（如有20mL病毒上清液，則需要加5mL慢病毒濃縮液），置于冰上，每20～30min上下混合一次，共進(jìn)行3～5次；連同冰盒一同4℃放置過夜。

7） 過夜后，離心機(jī)4℃，4000g離心20min，離心2次，吸棄上清，可看到管壁病毒沉淀，用適當(dāng)體積重懸病毒沉淀。

8）病毒分裝與保存：將病毒以40～50μL分裝，后保存于-80℃。